稳定表达T7 RNA聚合酶BHK-21细胞株的构建

2022-06-01陈宇婧张艺艺黄正阳石建州刘阳坤姚伦广

中国畜牧兽医 2022年4期

陈宇婧,张艺艺，黄正阳，石建州，2，3，刘阳坤，2，3，邱礽，2，3，姚伦广，2，3，李娜，2，3

（1.南阳师范学院生命科学与农业工程学院，南阳 473061；2.河南省畜禽保健品工程技术研究中心，南阳 473061；3.河南省动物疫病诊断与综合防控工程技术研究中心，南阳 473061）

反向遗传学（reverse genetics）是一种分子遗传学方法，通过基因水平的操作来揭示生命发展规律。病毒的反向遗传学系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在病毒基因结构、病毒蛋白功能、病毒与宿主互作、病毒致病机制和疫苗开发等研究中发挥明显优势，也是RNA病毒的研究热点[1-2]，但是RNA病毒在体外拯救效率低[3]，因此，需要建立一种无需体外制备RNA和拯救效率高的体内拯救病毒的方法。T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase,T7 RNAP）/T7启动子系统是病毒反向遗传学技术中常用的转录系统。T7 RNAP是一种依赖DNA的RNA聚合酶，对T7启动子序列具有高度特异性，是分子克隆和反向遗传学操作中常用的RNA聚合酶[4]。T7 RNAP首次在噬菌体T7感染的大肠杆菌中被发现，是T7噬菌体染色体编码的一条单链酶[5-7]，具有高度启动子专一性，且能严格、特异地识别T7启动子[8-9]，不需要其他转录因子的协助[10]。含有T7启动子的目的基因在胞质内的转录可由T7 RNAP高效诱导[11-13]，而不用进入细胞核，这可以克服核膜对外源基因转录的屏障作用。另外，T7 RNAP在没有其他任何蛋白因子的协助下就可介导T7噬菌体晚期基因转录的顺利进行[14-15]。T7 RNAP和相应转录元件在宿主细胞体内进行转录，即可实现对相应重组病毒的拯救[16]。T7 RNAP转录产物的5′-端常形成发夹结构，此结构在哺乳动物细胞中对新生成的RNA可起到保护和稳定作用[7]，能够提高重组病毒的拯救效率。

幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney,BHK-21）是最常见的动物细胞类型之一，是英国学者在1961年使用来自5只1日龄叙利亚金仓鼠肾脏细胞分离建立的细胞系[17]。BHK-21细胞呈纤维样贴壁生长，可连续传代，常被用于繁殖动物病毒。目前已有多种病毒在BHK-21细胞中成功繁殖，包括日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）[18]、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）[19]、狂犬病毒（Rabies virus,RV）[20]和Sindbis病毒（Sindbis virus,SINV）[21]等，BHK-21细胞系能够用于大规模生产兽用疫苗等生物制品,也可以应用于轮状病毒等RNA病毒反向遗传学试验。构建稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系，对于T7启动子驱动的重组RNA病毒基因组的包装和拯救至关重要。本研究基于慢病毒载体系统构建了稳定表达T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP细胞株，为RNA病毒反向遗传学操作平台提供了研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK-293T细胞由河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室保存；BHK-21细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；慢病毒载体质粒、慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2.G均购自北京欧林生物科技有限公司；限制性内切酶（XmaⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；无内毒素质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自OMEGA Bio-Tek公司；psiCHECK2质粒购自Promege公司;反转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；高保真酶Q5®High-Fidelity 2×Master Mix和T4 DNA连接酶均购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 T7-pol慢病毒载体的构建与鉴定基于大肠杆菌BL21（DE3）中的T7 RNA序列（GeneBank登录号：NZ_CP081489.1），使用Primer Premier 5.0软件设计引物T7 RNAP-F和T7 RNAP-R（表1）扩增T7RNAP基因。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR反应体系20 μL：Q5®High-Fidelity 2× Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，大肠杆菌BL21（DE3）菌液模板1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳结束后进行胶回收纯化。使用XbaⅠ和BamHⅠ酶切慢病毒核心质粒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro和T7RNAP基因的胶回收产物并回收目的片段，然后使用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞。挑取单菌落进行PCR鉴定，得到的阳性克隆培养后提取重组质粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 慢病毒的包装转染前1 d，按照6×105/mL将HEK-293T细胞接种于24孔板。转染前2 h，将细胞板中的培养基更换为无血清的基础培养基。向无菌离心管中加入重组质粒1.5 μg，psPAX2载体1.2 μg，pMD2.G载体0.3 μg，再加入25 μL Opti-MEM混合均匀，室温孵育5 min。取5 μL Lipofectamine 3000与20 μL Opti-MEM混合，室温孵育5 min。之后，将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 3000按照1∶1比例混合，室温孵育20 min，形成DNA与Lipofectamine 3000的转染复合物。将转染复合物转移至HEK-293T细胞中，6～8 h后弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次后，每孔加入含10%血清的完全细胞培养基250 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养12～16 h后，更换为完全培养基。24 h后收集细胞上清于4 ℃保存，加入完全培养基继续培养。24 h后再次收集细胞上清，与第一次收集的细胞上清液进行混合，室温下以1 000 r/min离心5 min，去除细胞碎片，上清经0.45 μm无菌滤器过滤至1.5 mL无菌离心管中，4 ℃、5 000 r/min离心2 h后，弃上清晾干，按照20 μL/孔的量加入PBS重悬病毒沉淀，室温静置2 h，再次混匀后室温放置30 min，分装于无菌的EP管中，做好标记并于-80 ℃保存备用。

1.2.3 慢病毒滴度的测定使用DMEM完全培养基10倍梯度稀释1.2.2中的病毒。具体做法如下：取铺好细胞的96孔板，每孔含有培养基90 μL，第1排孔每孔加入待测病毒原液10 μL，混匀后吸取10 μL混合液于第2排孔中，依次稀释至第6横孔。感染72 h后观察细胞荧光（如果病毒荧光较弱可加入polybrene以增强病毒的细胞感染能力）。病毒滴度（TU/mL）=细胞数×荧光百分比×103/病毒原液体积（μL）。

1.2.4 稳定表达T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP细胞株的筛选

1.2.4.1 嘌呤霉素（Puro）抗性筛选浓度的测定按照4.5×105～5×105/mL将HEK-293T细胞接种于48孔板，在37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h。待细胞密度达到80%～90%时，弃去培养基，PBS（pH 7.4）缓冲液洗涤2次，然后分别加入含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL嘌呤霉素以及10%小牛血清的DMEM培养基，每72 h更换1次筛选培养基。筛选1周后，能够把所有细胞全部杀死的最低嘌呤霉素浓度即为嘌呤霉素抗性筛选的最佳浓度。

1.2.4.2 慢病毒感染BHK-21细胞按照8×105～10×105/mL将BHK-21细胞接种于6孔板，在37 ℃、5% CO2培养箱内培养，待细胞密度达到70%～80%时进行病毒感染。将1.2.2中收集的病毒液分别以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1、5、10和20感染BHK-21细胞，72 h后观察荧光情况，筛选最佳感染复数。将1.2.2中收集的病毒液以及空载体重组慢病毒以最佳感染复数分别加于BHK-21细胞中，培养过夜。将培养基更换为含10%血清的DMEM完全培养基，继续培养48 h，PBS洗涤2次后加入6 mL含有最适嘌呤霉素的筛选培养基进行培养。前3～4 d每天更换培养基，之后每2～3 d更换一次培养基，直到荧光显微镜中观察到90%以上的细胞发出绿色荧光。通过嘌呤霉素的筛选得到稳定表达的细胞株，并将细胞冻存，等待进一步检测。

1.2.5 检测T7 RNAP活性的重组质粒pT7-hRluc构建及鉴定根据海肾荧光素酶（hRluc）基因序列设计特异性引物hRluc-F和hRluc-R（表1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以psiCHECK2质粒为模板进行扩增，并对扩增产物进行纯化，纯化产物和pT7载体利用XmaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，对酶切产物进行回收，连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞。对菌液PCR鉴定得到的阳性菌液提取质粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.6 BHK-21-T7 RNAP细胞株中T7RNAP基因的稳定性及活性鉴定设计3对检测引物（T7 RNAP-1、T7 RNAP-2和T7 RNAP-3）（表1），利用RT-PCR鉴定获得的稳定表达T7 RNAP的细胞株。收集获得的稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞，并设定慢病毒空载体组和BHK-21空白细胞组进行对照，提取细胞总RNA进行RT-PCR检测，PCR扩增体系同1.2.1。同时利用所构建的检测质粒pT7-hRluc对稳定筛选细胞株和BHK-21细胞空白对照组进行转染，测定检测质粒上T7启动子所驱动的hRluc酶活性，通过检测2组细胞hRluc报告基因的活性差异，可以反映hRluc的转录水平，以判断稳定筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP是否有活性。将pT7-hRluc检测质粒转染筛选的稳定细胞株，转染步骤同1.2.2。在转染36 h后，使用荧光素酶报告系统检测试剂盒进行检测，根据说明书进行操作。用PBS清洗细胞后，加入现配的1×PLB（passive lysis buffer），每孔65 μL。然后摇匀置于-80 ℃冰箱，反复冻融3次，充分裂解细胞。最后收集在1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min。取96孔黑色酶标板，每孔加入20 μL细胞裂解上清液，每个待测样品做3孔重复。然后在避光环境下加入现配的hRluc1×Stop&GLO试剂（1∶50），每孔30 μL，摇匀，快速读取hRluc的酶活数值,并利用软件GraphPad Prism 5.0进行作图分析。每个转染组做3个重复。

1.2.7 统计分析不同组之间的hRluc活性差异采用GraphPad Prism 5.0软件进行Student’s-t检验。试验结果以平均值±标准差表示，P<0.05 表示差异显著；P<0.01表示差异极显著；P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 慢病毒重组质粒构建

利用引物（T7 RNAP-F/R）从大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA中扩增T7RNAP基因，在2 700 bp处有明亮的条带（图1），同预期结果相同。重组质粒的PCR鉴定结果如图2所示，挑取的3个单菌落均为阳性。选取2个阳性克隆菌液抽提质粒并测序，结果表明重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP构建成功。

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，阴性对照；2，T7 RNAP PCR扩增结果M，Trans2K Plus DNA Marker;1，Negative control;2，The result for PCR amplification of T7 RNAP图1 T7 RNAP基因扩增Fig.1 Amplification of T7 RNAP gene

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3～5，菌落PCR结果M:Trans2K Plus DNA Marker;1，Positive control;2，Negative control;3-5，Colony PCR results图2 T7 RNAP重组质粒菌落PCR鉴定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid T7 RNAP colony by PCR

2.2 HEK-293T细胞系转染及慢病毒滴度鉴定

利用HEK-293T细胞对慢病毒进行包装，48和72 h各收集一次病毒上清，测得混合重组慢病毒的滴度为1.0×108TU/mL。

2.3 稳定表达T7 RNAP的BHK-21-T7 RNAP细胞株的筛选

测定结果表明，1周时间把所有BHK-21细胞全部杀死的最低嘌呤霉素浓度为4 μg/mL，即嘌呤霉素抗性筛选的最佳浓度为4 μg/mL。

将重组慢病毒分别以MOI为1、5、10和20感染BHK-21细胞，72 h后于荧光显微镜下观察，结果表明，当MOI为1和5时，感染后细胞状态较好，均观察到明显绿色荧光，且当MOI为5时荧光细胞数目更多（图3），即为慢病毒的最佳感染复数。

A、C、E和G，重组慢病毒以MOI为1、5、10、20感染BHK-21细胞的荧光图;B、D、F和H，重组慢病毒以MOI为1、5、10、20感染BHK-21细胞的白光图A,C,E and G，BHK-21 cells were infected with recombinant lentiviral particles at MOI of 1,5,10,20 and visualized by fluorescence microscopy imaging,respectively；B,D,F and H,BHK-21 cells were infected with recombinant lentiviral particles at MOI of 1,5,10,20 and visualized by white light microscopy imaging,respectively图3 慢病毒以不同感染复数对BHK-21细胞转导效果的荧光显微镜观察图（200×）Fig.3 Fluorescence microscope observation of the transduction effect of lentivirus at different MOI on BHK-21 cells （200×）

将重组慢病毒以MOI为5对BHK-21细胞进行转导，并以空载体重组慢病毒转导BHK-21细胞作为对照，以含有4 μg/mL嘌呤霉素的筛选培养基进行培养，2周后获得稳定遗传的BHK-21-T7 RNAP细胞株与对照细胞株（图4）。

A、B，BHK-21-T7 RNAP细胞株荧光图和白光图；C、D，对照细胞株荧光图和白光图A and B，Fluorescence diagram and white light diagram of BHK-21-T7 RNAP cell strain;C and D，Fluorescence diagram and white light diagram of control cell strain图4 BHK-21-T7 RNAP细胞株与对照细胞株的荧光显微镜观察图（200×）Fig.4 Fluorescence microscope observation of the BHK-21-T7 RNAP cell strains and control cell strain （200×）

2.4 重组质粒pT7-hRluc构建及鉴定

利用特异性引物进行hRluc基因的PCR扩增，在1 000 bp附近有明亮的条带（图5），同预期大小相符。重组质粒pT7-hRluc鉴定中，从平板中挑取5个单菌落进行PCR鉴定，结果如图6，挑取的5个单菌落均为阳性，且经测序比对分析显示序列正确，证明pT7-hRluc检测质粒构建成功。

M，Trans2K Plus DNA Marker；1、2，hRluc基因PCR扩增结果M，Trans2K Plus DNA Marker;1 and 2，The result for PCR amplification of hRluc gene图5 hRluc基因PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification results of hRluc gene

M，Trans2K Plus DNA Marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3～7，重组质粒的菌落PCR检测M，Trans2K Plus DNA Marker;1，Positive control;2，Negative control;3-7，Colony PCR detection of recombinant plasmid图6 pT7-hRluc重组质粒菌落PCR鉴定Fig.6 PCR identification of the recombinant plasmid pT7-hRluc colony

2.5 BHK-21-T7 RNAP细胞株中T7 RNAP基因的稳定性及活性鉴定

2.5.1 RT-PCR检测 RT-PCR检测结果如图7所示，BHK-21-T7 RNAP细胞株中均能够扩增到T7RNAP基因条带，慢病毒空载体组和BHK-21空白细胞组均无扩增条带，说明外源基因稳定插入所构建的细胞株基因组中。

M，Trans DNA Marker Ⅰ；1、4、7，BHK-21-T7 RNAP细胞组；2、5、8，慢病毒空载体组；3、6、9，BHK-21空白细胞组M，Trans DNA Marker Ⅰ;1,4 and 7,BHK-21-T7 RNAP cell group;2,5 and 8:Lentivirus vector control group;3,6 and 9:BHK-21 blank cell group图7 BHK-21-T7 RNAP细胞株中T7 RNAP基因的RT-PCR检测Fig.7 RT-PCR detection of T7 RNAP gene in BHK-21-T7 RNAP cell strain

2.5.2 hRluc活性检测利用pT7-hRluc检测质粒转染筛选的稳定细胞株，对hRluc活性进行检测，结果显示，BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc活性与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高（P<0.01）（图8）。

**，差异极显著（P<0.01）**，Extremely significant difference （P<0.01）图8 hRluc活性检测结果Fig.8 The activity of hRluc

3 讨论

慢病毒载体系统是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）为基础发展起来的基因工程载体，此系统由载体、辅助载体和包装细胞株组成[22-23]。相比于其他载体系统，它适用于更多种类的宿主细胞，并且慢病毒载体对于分裂细胞和非分裂细胞都具有感染力，整合能力强，能使宿主染色体有效整合外源基因，实现外源基因的长期高效表达。此外，慢病毒系统容量大，经过改造的慢病毒载体可以接纳10 kb大小的外源基因[24-25]。利用慢病毒载体系统建立稳定的转基因细胞株，能够在基因功能、疫苗和生物制品开发等生物研究中发挥重要作用。

T7 RNAP具有高度启动子专一性，高特异性识别T7启动子和终止子序列，其能够在不借助其他辅助因子的情况下，介导T7启动子下游的外源基因的高效表达，被广泛应用于RNA病毒的反向遗传学系统中。目前已有国内外学者建立了表达T7 RNAP的细胞株。van Gennip等[26]建立了表达T7 RNAP的猪肾细胞株SK6/T7，该细胞株可以提高猪瘟病毒反向遗传操作的效率。郑海学等[27]通过逆转录病毒基因转导和假病毒包装的技术建立了稳定表达T7 RANP的细胞株IBRS/T7，并利用该细胞株拯救出猪水疱病病毒。吴锦艳等[3]利用逆转录病毒载体系统将T7RNAP基因整合进猪源细胞，获得稳定表达T7 RANP的PK15和SK6细胞株。BHK-21细胞系对于多种病毒敏感，可以用于多种病毒的增殖和纯化，本研究利用慢病毒载体系统筛选出稳定表达T7 RNAP的BHK-21-T7RNAP细胞株，能够为多种RNA病毒反向遗传学平台的建立提供细胞基础。

本研究一方面将目的基因T7RNAP导入慢病毒质粒获得重组慢病毒质粒，利用包装系统转染HEK-293T细胞后，重组慢病毒的滴度高达1.0×108TU/mL。进一步试验发现，在MOI为5的条件下，重组慢病毒感染BHK-21细胞的荧光细胞量较高，且细胞整体状态较好。随后，摸索了嘌呤霉素的在BHK-21细胞中的使用浓度，发现使用浓度为4 μg/mL嘌呤霉素能够有效进行抗性筛选，所筛选的细胞均含有嘌呤霉素抗性基因，说明慢病毒系统中的抗性基因稳定插到细胞基因组中。经RT-PCR及测序鉴定证明,序列与所克隆的T7 RNAP序列一致。同时此细胞株转染含有T7-启动子驱动的hRluc的报告载体后，通过检测hRluc报告基因的活性来反映hRluc的转录水平，以判断稳定筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP是否有活性。结果显示，hRluc的活力与对照组相比极显著升高，证明所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株能够表达有活性的T7 RNAP，具有驱动T7启动子下游基因转录的作用。该细胞系的成功建立使得在DNA水平上研究和利用RNA病毒基因的突变、缺失、插入和替换成为可能，为RNA病毒反向遗传学操作平台提供了研究基础。