MitoQ对犬骨髓间充质干细胞线粒体功能及抗氧化能力的影响

钟丽君，邓嘉强，古丛伟，沈留红，曹随忠，余树民

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)是一类具有自我更新和分化潜能的多能干细胞，已成为再生医学领域的一种极具潜力的治疗材料。然而，由于体内外生存环境差异，在体外长期传代培养过程中细胞内活性氧(reactive oxygen species， ROS)大量蓄积，导致BMSCs线粒体功能障碍与氧化还原稳态失衡，最终引起BMSCs生物学功能受损甚至丢失，严重限制了BMSCs治疗效率。

近年来，抗氧化剂预处理是维持细胞内氧化还原稳态和改善BMSCs生物学功能的有效策略。但是大多数抗氧化剂无法穿透线粒体的双层膜结构到达线粒体内部发挥作用。线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone(MitoQ)是一种泛醌衍生物，由辅酶Q10(CoQ10)和三苯基磷(TPP)组成。研究发现，MitoQ不仅可以轻松穿透线粒体膜并大量积累在线粒体中，还可以在线粒体呼吸链复合物Ⅱ的作用下，连续还原为具有抗氧化作用的泛醇形式，被广泛用于脓毒症和睾丸氧化损伤等氧化应激模型。然而，应用MitoQ来改善BMSCs生物学功能的研究仍未见报道。本实验在体外培养时添加MitoQ预处理，评价犬BMSCs的线粒体功能以及抗氧化基因的表达水平，为进一步提高犬BMSCs的临床应用效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6～12月龄健康中华田园犬，购于四川省雅安市。

胎牛血清FBS(TransGen Biotech，北京)；LG-DMEM干粉培养基(GIBICO，美国)；胰蛋白酶干粉(Sigma，美国)；油红O染色试剂盒、茜素红染色试剂盒、EDTA、肝素钠(Solarbio，北京)；成脂分化诱导液、成骨分化诱导液(Cyagen，美国)；4%多聚甲醛、谷氨酰胺、Trizol试剂(生工生物，上海)；总RNA提取试剂、反转录试剂盒与SYBRPremix ExTM Ⅱ(Takara，大连)；MitoQ(MCE，上海)；CD31、CD90、CD105抗体(博奥森，北京)；ATP含量测定试剂盒(南京建成，南京)；青链霉素混合液100×、线粒体膜电位试剂盒(碧云天，上海)。

1.2 试验方法

1.2.1 BMSCs分离与培养

对犬进行股骨穿刺，抽取适量骨髓与肝素钠混合。再加入PBS混匀，2 000 r·min8 min离心两次。弃上清，加入完全培养液。计数后按10mL密度接种于培养皿中，于37 ℃，5% CO的细胞培养箱中培养。待细胞铺满培养皿底后，消化离心，加入完全培养液，按1.5×10mL的密度传代。

1.2.2 BMSCs鉴定

取生长状态良好的P3代BMSCs以3×10mL的密度接种于24孔板中培养，用于分化鉴定与表面标志鉴定。采用免疫荧光鉴定BMSCs表面标志，BMSCs经PBS清洗后，加入4%的多聚甲醛固定30 min，再加PBS清洗3次。于室温加入羊血清，封闭30 min后吸出血清，分别加入CD105(1∶50)、CD90(1∶50)、CD31(1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加入二抗-FITC(1∶500)于37 ℃避光孵育1 h，观察显色情况。为了诱导分化，用成骨分化诱导液和成脂分化诱导液培养BMSCs，每3 d更换一次诱导液，培养21 d和14 d后，分别用茜素红和油红O对BMSCs进行染色。

1.2.3 MitoQ处理

将生长状态良好的第三代(P3)BMSCs进行接种培养，待细胞贴壁后更换新鲜的培养液；将同批次生长状态良好的第六代(P6)BMSCs进行接种培养，待细胞贴壁后更换含有MitoQ终浓度为0.1、0.5和1 μmol·L的完全培养液。均以同批次的未作处理的第六代(P6)BMSCs作为对照，每组3个重复，在37 ℃，5%CO培养箱中培养48 h后用于后续试验。

1.2.4 BMSCs抗氧化基因与线粒体功能相关基因mRNA水平的检测

BMSCs以2×10mL的密度接种于12孔板中培养。按1.2.3节处理BMSCs后，加入Trizol试剂，提取细胞总RNA，进行反转录。以反转录后的cDNA为模板，由上海生工公司合成引物(引物序列及参数见表1)，进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应。用CFX96 RT-PCR Detection System检测C值，采用2-ΔΔC法计算在各组细胞中目的基因的相对表达量。

表1 引物参数

1.2.5 BMSCs线粒体膜电位的检测

BMSCs以2×10mL的密度接种于6孔板中培养。按1.2.3节处理BMSCs后，离心收集细胞，加入0.5 mL细胞培养液与JC-1染色工作液混匀孵育20 min后，用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次。离心收集沉淀，重悬于JC-1染色缓冲液(1×)中，在荧光显微镜下观察，并用荧光酶标仪在激发波长490 nm，最佳发射波长530 nm以及激发波长525 nm，发射波长590 nm分别检测细胞的荧光强度，用红绿荧光的相对比例计算线粒体膜电位水平。

1.2.6 BMSCsATP含量的检测

BMSCs以1×10mL的密度接种于6孔板中培养。按1.2.3节处理BMSCs后，根据ATP含量测试盒说明书提取样品，使用酶标仪检测ATP含量。

1.3 统计学分析

数据以均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)与检验分析组间差异，<0.05表示有显著差异。采用GraphPad Prism 7软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 BMSCs的形态及培养特征

P1代、P3代BMSCs呈现细长梭形，轮廓清晰，折光性强，增殖速度较快。而P6代BMSCs呈现增大和扁平化的衰老形态，折光性下降，颗粒物质增多，增殖速度减慢(图1)。

A-C 分别为P1、P3和P6代BMSCs的形态(比例尺=100 μm)。

2.2 BMSCs的鉴定

免疫荧光检测发现，BMSCs阳性表面标志物CD105和CD90高表达，阴性表面标志物CD31弱表达(图2-A-D)；细胞成骨和成脂分化诱导后，分别出现红色的钙化结节与橘红色的脂肪颗粒(图2-E、F)，表明该细胞可分化为成骨细胞与脂肪细胞。以上结果证实了我们从骨髓中分离和培养的细胞是BMSCs。

A-F 分别为细胞表面标志物CD105、CD90、CD31、阴性对照的免疫荧光检测结果(比例尺=200 μm)；BMSCs成骨分化诱导和成脂分化诱导后的染色结果(比例尺=100 μm)。

2.3 体外传代对BMSCs抗氧化基因表达与线粒体功能的影响

qRT-PCR数据显示，与P3代相比，P6代BMSCs抗氧化基因2与-相对表达量极显著下调(<0.01)，1与显著下调(<0.05)(图3-A)；线粒体融合基因2显著上调(<0.05)，1和1基因没有显著性差异(>0.05)(图3-C)；线粒体分裂基因1极显著下调(<0.01)，1显著下调(<0.05)(图3-D)；线粒体生物合成相关基因-1极显著下调(P<0.01)(图3-B)；线粒体膜电位水平以及ATP含量均极显著下降(<0.01)(图3-E、F)。结果表明，随着体外传代次数增加，BMSCs抗氧化能力减弱，线粒体融合略有增强，线粒体分裂明显减弱，且线粒体合成功能受损。

A-F分别为BMSCs的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px；PGC-1α；Opa1、Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1基因的相对表达量；线粒体膜电位水平(比例尺=100 μm)和ATP含量。*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。ns,不显著。下同。

2.4 MitoQ对BMSCs抗氧化基因与线粒体功能相关基因表达的影响

与P6代对照组相比，MitoQ处理组(1μmol·L)1、、2和-基因，以及MitoQ处理组(0.5 μmol·L)1、2和-基因的相对表达量均极显著上调(<0.01)，且MitoQ处理组(0.5 μmol·L)的基因相对表达量显著上调(<0.05)(图4-A)。此外，所有MitoQ处理组2相对表达量均显著上调(<0.05)，而1只在MitoQ处理组(0.5 μmol·L)中显著上调(<0.05)；MitoQ处理组(0.5 μmol·L和1 μmol·L)1的相对表达量均极显著上调(<0. 01)；且MitoQ处理组(0.5 μmol·L)的-1基因相对表达量显著上调(<0.05)(图4-B)。以上结果表明，MitoQ(0.5 μmol·L和1 μmol·L)添加后，BMSCs线粒体融合略有增强，线粒体分裂、线粒体生物合成以及抗氧化能力均显著增强。

图4 MitoQ对BMSCs抗氧化基因与线粒体功能相关基因表达的影响

2.5 MitoQ对BMSCs线粒体膜电位与ATP含量的影响

与P6代对照组相比，所有MitoQ处理组线粒体膜电位水平均极显著增高(<0.01)，(图5-A)；MitoQ处理组(0.5 μmol·L和1 μmol·L)ATP含量均极显著增高(<0. 01)(图5-B)，且均以0.5 μmol·L作用浓度最佳。以上结果表明，MitoQ(0.5 μmol·L和1 μmol·L)能显著增加线粒体膜电位与ATP的含量，改善BMSCs线粒体功能。

A、B分别为MitoQ处理后BMSCs的线粒体膜电位水平(比例尺=100 μm)与ATP含量。

3 讨论

将MSCs用于临床治疗通常需要对MSCs进行大量的体外扩增培养，但是长期的体外扩增培养大多伴随氧化应激水平升高，从而诱导MSCs衰老，表现为细胞增殖和多系分化潜能降低，制约了MSCs的临床应用。大量研究发现，线粒体功能变化与MSCs体外扩增时的衰老存在紧密的联系，Stab等发现脂肪来源的MSCs(ADSCs)体外长期扩增培养后，细胞内的ROS水平增加，线粒体分裂融合失衡，线粒体膜电位降低，并且表现出衰老特征； Seok等发现长期培养会导致人胎盘来源的MSC(PD-MSC)中线粒体功能障碍，且衰老标志物如SA-β-gal和p21增加，增殖、分化潜能降低；Li等发现，随着传代次数的增加，人BMSCs线粒体动力学失衡，ROS大量蓄积，最终导致BMSCs复制性衰老。本研究同样发现，与P3代相比，P6代BMSCs抗氧化基因表达下调；线粒体融合明显增强，线粒体分裂与线粒体生物合成能力显著减弱；线粒体膜电位极显著降低且ATP合成能力削弱，表明随着体外传代次数增加，犬BMSCs线粒体功能明显受损。

维持线粒体功能的稳定是缓解BMSCs氧化应激从而提高其临床应用效率的关键。研究发现，褪黑素，黄芪多糖、牛磺酸脱氧胆酸和CoQ10等抗氧化剂能调节线粒体融合分裂，稳定线粒体膜电位，增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性来清除过量的ROS，从而缓解MSCs的衰老。作为CoQ10的衍生物，MitoQ可维持线粒体形态，提高细胞线粒体膜电位与ATP水平，增强SOD和GSH-Px的活性，减少氧化应激条件下线粒体ROS的蓄积，在高血糖、血小板减少症和椎间盘退变等多种疾病中发挥有益作用。本研究同样发现在P6代BMSCs中添加MitoQ预处理，能极显著促进线粒体分裂，稳定线粒体膜电位，同时促进线粒体ATP合成。但是MitoQ处理后线粒体融合基因2同样略有增强，这可能是由于BMSCs抗氧化能力削弱，线粒体可以通过融合减少ROS的生成，保护细胞免受凋亡。此外，与Zhou等的发现相似，MitoQ还能显著上调BMSCs抗氧化基因1、2、和-的mRNA表达，增强BMSCs抗氧化能力。

综上所述，MitoQ不仅能显著提高BMSCs线粒体分裂能力，稳定线粒体膜电位，促进线粒体合成ATP，还能显著上调抗氧化基因1、2、和-的表达，增强BMSCs抗氧化能力，本试验为进一步提高犬BMSCs的应用效率打下了理论基础。