四川省部分地区肉牛源产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的分离鉴定与耐药性分析

李 姗，黄方园，张玉龙，才冬杰，左之才

(四川农业大学 动物医学院，四川 温江 611130)

肺炎克雷伯菌(，Kp)是肠杆菌科克雷伯氏菌属的成员，是一种会引起人与动物发病的革兰氏阴性条件性致病菌。据报道，肺炎克雷伯菌能够引起人和动物伤口感染、肺炎、脑膜炎、泌尿系统发炎，甚至败血症等病症。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，该菌已出现了多重耐药现象，其中，产超广谱-内酰胺酶(ESBLs)菌株的感染问题日趋严重，其对药物的敏感性逐年下降。目前，在肺炎克雷伯菌中所发现的ESBLs主要以、、-基因为主。研究发现，该类菌对多种抗菌药物均已产生较强的耐药性，发病率和死亡率明显升高，临床治疗难度增大，给养殖业造成的损失日趋严重。荚膜抗原(K抗原)是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子之一，荚膜结构被覆菌体表面，可保护菌体不被吞噬。根据K抗原型细菌荚膜多糖结构及其抗原性的不同，可将肺炎克雷伯菌划分为不同的K血清型，其中，K1、K2、K5、K20、K54、K57为强毒力型肺炎克雷伯菌。

四川是肉牛重要的输出地。为此，本研究从四川省内15个养殖场采集222份肉牛鼻腔拭子样本，针对肺炎克雷伯菌开展分离鉴定、药物敏感性试验、耐药基因检测、小鼠致病性试验、毒力基因检测等，旨在为临床预防和控制产ESBLs肺炎克雷伯菌的传播，以及深入研究该菌耐药和毒力变化的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从四川省宜宾、泸州等地15个肉牛养殖场采集222份肉牛源鼻腔拭子样本，低温保存并运输至实验室。

分子量标记(DL2000 DNA marker)、2×PCR Master Mix(blue)、灭菌双蒸水(ddHO)，均购于成都擎科伟业生物技术有限公司。LB培养基、营养肉汤培养基、MH培养基，均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；麦康凯培养基，购于北京陆桥技术股份有限公司；CHROMagar ESBL显色培养基，购于上海欣中生物工程有限公司；琼脂粉，购于上海伊卡生物技术有限公司；药敏纸片，购于英国Oxoid公司。

SimpliAmpPCR仪，美国Thermo Fisher公司；DYY-6D型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；GelDoc全自动凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

C57BL/6无菌小鼠，购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离纯化

将采集的鼻腔拭子样本划线于麦康凯培养基，挑选培养基上的红色菌落接种于CHROMagar ESBL显色培养基，37 ℃恒温培养18～20 h后，挑取深蓝色菌落于营养肉汤培养基，37 ℃恒温培养16～18 h，再划线于营养肉汤培养基，在麦康凯培养基上进行纯化。

1.2.2 16S rRNA序列测定

取已纯化的分离菌菌液，直接用PCR扩增其16S rRNA。扩增所用的通用引物序列如下：上游引物F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反应体系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，去离子水8.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，纯化菌液2.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸7 min。取PCR反应产物5 μL，在1.2%琼脂糖凝胶中电泳30 min，在凝胶成像系统中观察结果，取PCR阳性产物送成都擎科伟业生物技术有限公司测序。将分离菌株测序结果与GenBank中已发表的序列进行Blast比对，分析分离株的同源性关系。

1.2.3 细菌表型筛选

参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的双纸片协同扩散试验，对疑似产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株进行筛选确认。将待测菌制成0.5麦氏浊度的菌悬液，用无菌棉棒均匀涂布于MH平板上，贴上头孢他啶(30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)药敏纸片，37 ℃孵育18～24 h后观察结果。头孢他啶/克拉维酸或头孢噻肟/克拉维酸的单个圆盘直径与头孢他啶或头孢噻肟的差值≥5 mm，认为是阳性。

1.2.4 药物敏感性试验

参照CLSI推荐的K-B纸片扩散法对分离株进行药敏试验。将上述分离确认的产ESBLs肺炎克雷伯菌接种于营养肉汤培养基，37 ℃恒温培养12～16 h后，将所得菌液配置为0.5麦氏浊度，用无菌棉棒蘸取菌液均匀涂布整个平板，夹取药敏纸片贴于平板表面，放置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h，记录抑菌圈直径。

1.2.5 耐药基因检测

根据药敏试验结果，选取-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、四环素类耐药基因进行PCR检测(表1)。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddHO 8.5 μL。PCR产物经成都擎科伟业生物技术有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中已有序列进行比对。

表1 用于扩增耐药基因的引物信息

1.2.6 血清型分型与毒力基因检测

对分离株进行K1、K2、K5、K20、K54、K57强毒力荚膜血清型分型，及、、、、等5种毒力基因检测(表2)。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddHO 8.5 μL。PCR产物经成都擎科伟业生物技术有限公司纯化和测序，将测序结果与GenBank中已有序列进行比对。

表2 用于荚膜血清型与毒力基因检测的引物信息

1.2.7 小鼠致病性试验

将分离株接种于LB培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养12～16 h后取出，用平板计数法测定菌液浓度，待其为1.2×10CFU·mL时，备用。

取C57BL/6小鼠34只，分为17组，每组2只(雌雄各一)，设置空白对照组。吸取上述备用菌液0.2 mL腹腔注射小鼠，空白对照组注射等体积无菌生理盐水。观察小鼠临床症状和死亡情况，并及时剖解小鼠，取各组小鼠组织器官，置于4%多聚甲醛溶液内固定，送往成都里来生物科技有限公司制作病理组织切片。

1.2.8 小鼠各器官细菌载量测定

将检测出K5、K20、K1荚膜血清型的毒株划分为强毒力菌株组，其余归为弱毒力菌株组。分别在强毒力菌株组、弱毒力菌株组内各随机选取3只刚死亡小鼠，采集小鼠肺、脾、肝、心、肾，称重、研磨，并进行梯度稀释，取稀释度为10、10、10的组织菌液均匀涂布于LB平板，每个稀释度重复2次，放置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h，记录在可计数区间内的菌落总数。

2 结果与分析

2.1 产ESBLs肺炎克雷伯菌的分离鉴定

对肉牛的鼻腔拭子样本进行细菌的分离培养，分离株在CHROMagar ESBL显色培养基上呈现深蓝色菌落(图1)，在麦康凯培养基上生长为黏液型红色菌落，在营养肉汤培养基上生长的菌落大而厚实、光亮，呈凸起、灰白色黏液型菌落。

图1 分离株在产ESBL显色培养基(A)、麦康凯培养基(B)、营养肉汤培养基(C)上的菌落形态

2.2 菌株的16S rRNA分子鉴定

16S rRNA基因扩增结果显示，PCR扩增产物约为1 500 bp(图2)，与预期目的片段大小一致。对分离株16S rRNA基因测序结果进行Blast比对分析，结果显示，与肺炎克雷伯菌的一致性均在99%以上，确认分离株均为肺炎克雷伯菌。

M，DL2000 DNA marker；1～2，阳性样品；3，阴性对照。

2.3 菌株的药物敏感性

依据双纸片协同扩散试验结果，分离株均为产ESBLs肺炎克雷伯菌。药物敏感性试验显示，分离株对青霉素类、头孢类、四环素类、磺胺和氨基糖苷类普遍耐药，对苯唑西林、阿莫西林、四环素、链霉素的耐药率在62.50%～93.75%，但对亚胺培南敏感。将分离得到的全部16株产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药谱整理于表3，其中，菌株根据来源地进行编号，泸州地区菌株编号为LZ1～LZ4，宜宾地区菌株编号为YB1～YB12。

表3 肺炎克雷伯菌分离株的耐药结果

对分离株进行磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、-内酰胺类药物耐药基因的扩增检测(图3、图4)，结果显示：-内酰胺类耐药基因、、-、--1、--9、--2的检出率分别为68.75%、62.50%、68.75%、87.50%、87.50%、18.75%，1、2、(3)-Ⅱ、(6′)-Ⅰ、和的检出率均为100%，(3′)-Ⅰ、、(3)-Ⅰ的检出率分别为87.50%、68.75%、6.25%。

M，DL2000 DNA marker；泳道1～16，sul2基因阳性样品；17，阴性对照。

M，DL2000 DNA marker；泳道1～3、5～6、8～10、13～15，TEM基因阳性样品；泳道4、7、11、12、16，阴性样品；17，阴性对照。

2.4 菌株的血清型分型和毒力基因检测结果

在16株分离株中，针对荚膜血清型K1、K2、K5、K20、K54、K57，血清型K1和K20分别检出1株，K5检出3株。毒力基因有16株，检出率为100%；有15株，检出率为93.75%；有14株，检出率为87.50%；有12株，检出率为75.00%；仅1株。由荚膜血清型和毒力基因的结果推测，部分分离株具有较强的致病性。部分基因扩增结果如图5、6所示。

M，DL2000 DNA marker；泳道10、13、15，荚膜血清型K5基因阳性样品；泳道1～9、11～12、14、16，阴性样品；17，阴性对照。

2.5 菌株对小鼠的致病性

M，DL2000 DNA marker；泳道2～16，毒力基因mrkD基因阳性样品；泳道1，阴性样品；17，阴性对照。

将各菌株对小鼠的致病性整理于表4。攻毒4 h后，强毒力菌株组小鼠反应迟钝，扎堆；弱毒力菌株组小鼠无明显异常。攻毒12 h后，强毒力菌株组小鼠死亡率100%(10/10)；弱毒力菌株组小鼠死亡率72.7%(16/22)，未死亡小鼠也表现抽搐、蜷缩等临床症状。解剖观察发现，弱毒力菌株组小鼠心、肺、肝、肾、脾充血肿胀，强毒力菌株组肿大和淤血的情况更加明显，而空白对照组小鼠表现正常，解剖未发现组织病变(图7、图8)。

A，空白对照组小鼠剖检整体情况无异常；B，弱毒力菌株组小鼠剖检整体情况为胆囊肿大，肠道积气积液、肿大；C，强毒力菌株组小鼠整体剖检情况为明显胆囊肿大，肠道积气积液、肿大。

A，空白对照组小鼠的肺无异常；A1，弱毒力菌株组小鼠肺充血肿大；A2，强毒力菌株组小鼠肺明显充血肿大。B，空白对照组小鼠脾无异常；B1，弱毒力菌株组小鼠脾淤血肿大；B2，强毒力菌株组小鼠脾明显淤血肿大。C，空白对照组小鼠肝无异常；C1，弱毒力菌株组小鼠肝淤血肿大；C2，强毒力菌株组小鼠肝明显淤血肿大。D，空白对照组小鼠肾无异常；D1，弱毒力菌株组小鼠肾充血肿大；D2，强毒力菌株组小鼠肾明显充血肿大。

表4 菌株对小鼠的致病性

空白对照组小鼠各器官未分离出细菌，但在攻毒小鼠的心、肝、脾、肺、肾中，强毒力菌株组的平均细菌含量分别为3.82×10、4.03×10、8.62×10、9.07×10、4.90×10CFU·g，弱毒力菌株组的平均细菌含量分别为3.60×10、1.07×10、

2.53×10、8.00×10、4.87×10CFU·g。综合细菌定殖情况和载菌量分析，强、弱毒株均可感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾等多种内脏实质器官，对肺的侵袭力相对最强，且强毒力菌株较弱毒力菌株对小鼠的侵袭力更强。

观察病理组织切片发现：小鼠心脏未见明显病理改变；肝轻度淤血，伴有少量中性粒细胞浸润；脾中组织被膜轻度增厚，白髓部分细胞坏死，呈“星空现象”，由大而不规则、浅染的巨噬细胞吞噬细胞碎片形成；肺呈轻度炎性浸润，局部区域肺泡膈轻微增厚；肾小球肿大，肾小囊腔几乎不可见，且肾中集合管局部出现絮状物沉积等病理改变(图9)。

A，肝淤血(100×)；B，肝胞核固缩，中性粒细胞(400×)；C，脾被膜增厚(100×)；D，脾细胞坏死形成“星空现象”(400×)；E，肺泡膈轻微增厚(100×)；F，肺中性粒细胞增多(400×)；G，肾小球肿大，絮状物沉积(100×)；H，肾小球肿大(400×)。

3 讨论

本试验从四川部分地区222份肉牛源样品中分离出16株(7.21%)产ESBLs肺炎克雷伯菌，通过药敏试验、耐药基因和毒力基因检测，以及相关致病性试验，期望能够在一定程度上反映临床用药情况和菌株的致病性情况，从而为肉牛源产ESBLs肺炎克雷伯菌病的治疗和预防提供参考依据。近年来，随着-内酰胺类抗生素的广泛应用，肺炎克雷伯菌对-内酰胺类抗生素的敏感性逐年下降，临床上的多重耐药现象也日趋严重，但国内有关动物源感染产ESBLs肺炎克雷伯菌的报道较少。本研究发现，调查地区的临床分离株对-内酰胺类药物的耐药情况严重，且多重耐药现象普遍。刀丽梅等报道，重庆地区牛源肺炎克雷伯菌中可检测出产ESBLs的耐药基因型有、、-，以为主；张颖欣等报道，在其调查的13个省份中，奶牛源产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药基因型以-为主。本试验对比了-内酰胺酶耐药基因在菌株中的检出率，检出率较高的类型有--1(87.50%)、--9(87.50%)、(68.75%)、-(68.75%)、(62.50%)，总体来看，以--1、--9亚型为主。-型ESBLs是一类对头孢类具有强大水解能力的酶。据报道，-型ESBLs耐药基因可以通过质粒、整合子、转座子等可移动元件，在质粒与染色体间，或从一个质粒到另一个质粒，或从一种细菌到另一种细菌进行转移，具有复杂的遗传传播背景。为有效控制肺炎克雷伯菌产生ESBLs和治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌的临床菌株感染，肉牛养殖场应当减少临床中抗生素的使用频次，并注意合理科学用药。蒙正群等研究发现，肺炎克雷伯菌对-内酰胺类、二代头孢菌素、磺胺类药物耐药。本试验发现，产ESBLs的肺炎克雷伯临床菌株，不仅对-内酰胺类药物耐药，而且还对四环素类、磺胺类和氨基糖苷类普遍耐药(四环素类、氨基糖苷类、链霉素、磺胺类耐药基因的检出率均接近100%，且与菌株药敏纸片试验结果相符)，说明产ESBLs肺炎克雷伯菌可携带其他类型的耐药基因传播，这也是造成分离株耐药性增强的原因之一。综上，产ESBLs肺炎克雷伯菌株具有较强的获得耐药性、克隆传播的能力和致病性，准确及时地开展分子流行病学监测，对于控制临床产ESBLs肺炎克雷伯菌株感染的暴发流行，和及时准确查明传染源等具有重要意义。

根据细菌荚膜多糖K抗原进行血清学分型，其中，K1、K2、K5、K20、K54和K57为动物临床常见的强毒力血清型，其临床致病能力强。本试验对分离菌株的血清型进行检测，发现强毒力菌株5株，其中属于K5型的有3株，这与多项研究报道的K1和K2型为常见的强毒力型菌株的结论有差异，推测可能与调查地区和感染的宿主有关。、、、、是肺炎克雷伯菌常携带的5个毒力基因，但这几种毒力因子只是肺炎克雷伯菌作为机会致病菌的低致病力的毒力因子，其中：和编码合成菌毛上的黏附素，位于菌毛顶端，该黏附素可激发机体的保护性免疫反应；与脂多糖的合成有关，以维持菌株细胞壁结构；是尿素酶基因。本研究发现，分离株携带、、、毒力因子比较多，推断是分离株产生较强毒力的原因之一。本研究获得的分离株中，携带的仅1株。有研究报道，是荚膜多糖合成相关的转录调控因子基因，可调控多种血清型合成，一般认为与K1、K2型肺炎克雷伯菌株有关，这从另一个侧面说明，该地区确实K1、K2血清型菌株的数量较少。

据报道，猪源肺炎克雷伯菌可引起小鼠肝、脾、肺病变；扭角羚源肺炎克雷伯菌引起肺、脾病变；肉牛上呼吸道肺炎克雷伯菌引起肺、肝和肠道病变。本试验选取全部肺炎克雷伯菌分离株进行小鼠致病性试验，病理剖检可见，死亡小鼠的肺、肝、脾、肾等实质器官均出现肿大、出血，肠道积气、积液、出血等病变。除心脏未见明显病理改变外，肝见轻度淤血、炎性浸润，脾中白髓部分细胞坏死，肺呈轻度炎性浸润，肾中的肾小球出现肿大和集合管局部絮状物沉积等病理改变，其中，强毒力菌株对小鼠组织造成的病理现象更加明显，推测强毒力菌株对肉牛的临床危害更加严重，应注重对强毒力菌株的预防和治疗。有研究表明，肺炎克雷伯菌能与中性粒细胞相互作用。中性粒细胞是机体抗击病原微生物最重要的固有免疫细胞，而菌体表面的厚荚膜可抵抗吞噬细胞的吞噬作用，是肺炎克雷伯菌重要的毒力机制之一。与菌体有关的脂多糖、黏附素和铁载体等都会引起机体致病，并且未被机体免疫系统杀灭的细菌能发生远处扩散和转移，这也是导致该菌虽然是呼吸道机会致病菌，却也能引起机体其他器官受损的原因之一。