急性ST段抬高型心肌梗死溶栓后循环微粒数量和功能的变化及其参与溶栓后缺血再灌注损伤的机制▲

王旭兰 吴皓宇 张 涛 王亚萍 王群让 常凤军

(1 咸阳职业技术学院医学院康复治疗技术专业教研室，陕西省咸阳市 712000，电子邮箱：wangxulan84@126.com； 2 陕西省人民医院心血管内科，西安市 710068； 3 商丘医学高等专科学校护理系，河南省商丘市 476000； 4 陕西中医药大学附属医院心内科，咸阳市 712000)

急性ST段抬高型心肌梗死(acute ST-segment elevation myocardial infarction,ASTEMI)是指有典型心绞痛症状且症状持续时间超过20 min，舌下含服硝酸甘油缓解不明显，并伴有肌钙蛋白升高和动态演变，同时心电图相应导联出现ST段抬高的急性心肌梗死。其病理基础是在原有冠状动脉狭窄的基础上再次发生斑块破裂而激活血小板，导致血栓形成和心肌细胞缺血、缺氧、坏死[1]。目前经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是公认的ASTEMI血运重建的有效措施，但许多基层医院尚无开展PCI的条件，或者患者及其家属拒绝PCI。而早期且及时溶栓的即刻疗效与直接PCI相似[2]。已有学者发现，人体内循环微粒可能通过内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和内皮素1途径损害内皮功能，参与急性心肌梗死的发生和发展[3]。但溶栓治疗是否会影响ASTEMI患者循环微粒的数量和功能，以及循环微粒是否参与溶栓后缺血再灌注损伤，目前尚未有研究报告。本研究探讨ASTEMI患者溶栓前后循环微粒数量及功能的改变，及其参与溶栓后心肌缺血再灌注损伤的可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年10月至2016年6月就诊于陕西中医药大学附属医院心内科的20例行溶栓治疗的ASTEMI患者作为ASTEMI组。ASTEMI诊断标准[4]：(1)情绪激动或劳累诱发的胸骨后压榨样疼痛或呼吸困难；(2)心电图存在ST段抬高、压低、T波和Q波等动态演变；(3)肌钙蛋白升高。纳入标准：(1)自愿加入研究；(2)性别不限，年龄≥18岁且≤75岁；(3)患者及其家属拒绝PCI；(4)临床资料完整。排除患有肾功能衰竭、未控制的高血压、严重感染性疾病等可能影响循环微粒数量及功能的疾病的患者。ASTEMI组中男性10例、女性10例，患者年龄35～60(42.34±12.68)岁。选取同期于陕西中医药大学附属医院进行健康体检的20例志愿者作为对照组。纳入标准：(1)自愿加入研究；(2)性别不限，年龄≥18岁且≤75岁；(3)临床资料完整。排除患有冠心病、高血压、 糖尿病、感染性疾病、严重创伤、风湿免疫系统疾病、肝肾功能衰竭等疾病的患者。对照组中男性10例、女性10例，研究对象年龄48～64(45.64±13.26)岁。两组研究对象的年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性；两组的胆固醇水平、三酰甘油水平、高密度脂蛋白水平、低密度脂蛋白水平、体重指数差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。本研究经陕西中医药大学附属医院医学伦理委员会审核，所有研究对象签署知情同意书。

表1 两组研究对象的临床资料的比较

1.2 溶栓方法 首先静脉推注重组组织型纤溶酶原激活剂15 mg，继而给予重组组织型纤溶酶原激活剂50 mg静脉滴注30 min，最后给予重组组织型纤溶酶原激活剂35 mg静脉滴注60 min。

1.3 循环微粒的提取 抽取ASTEMI组溶栓前与溶栓2 h后和对照组体检时的肘静脉血4 mL。参考文献[5]提取循环微粒：血液样本于4℃下4 000 r/min离心10 min，提取上层血浆，将上层血浆进一步离心(4℃，2 750 r/min，2 min)后所获得的上层即为乏血小板血浆，然后取2 mL乏血小板血浆进一步离心(4℃，3 250 r/min，45 min)使循环微粒沉淀于底部，加入100 μL RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，批号：C11875500BT)将循环微粒从离心管底部重悬。用二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：P1511-1)测定循环微粒含量后置于4℃冰箱(中国海尔公司)保存备用。

1.4 实验动物 采用抓阄法将18只SD大鼠随机分为动物对照组、实验1组、实验2组，每组6只。大鼠购买自陕西中医药大学动物实验中心[SYXK(陕)2020-005]，均为6周龄，体重(150±10)g，饲养在温度(20±2)℃、湿度(55±10)%环境下，12 ∶12暗光循环，自由饮用水、食用食物。

1.5 大鼠干预方法及内皮功能的检测 分别取来自动物对照组、ASTEMI组溶栓前和溶栓2 h后的循环微粒3 mg，用注射器经阴茎背静脉推注入对照组、实验1组、实验2组大鼠体内反应6 h，反应结束后断头处死大鼠，取大鼠心脏组织经固定、脱水、包埋后制作石蜡病理切片。然后采用免疫组化法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法)，使用双花扁豆凝集素试剂盒(中国上海雅吉生物科技有限公司，批号：YS06531B)检测eNOS、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在大鼠心肌组织中的表达情况[6]。根据阳性细胞(黄染即为阳性)着色强度计分：无黄色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、深棕黄色计3分。200倍显微镜下随机记录3个视野细胞总数及阳性细胞数后计算各组得分，得分=着色强度×阳性细胞数/细胞总数。

1.6 血管舒张功能检测 处死大鼠后取新鲜胸主动脉，参考文献[7]进行血管舒张功能检测。首先将血管置于通气(95% O2和5% CO2的混合气)并预冷的Kreb′s平衡液(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：PB180348；氯化钠119.0 mmol/L，碳酸氢钠25.0 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，氯化钙1.6 mmol/L，氯化钾4.7 mmol/L， 磷酸二氢钾1.2 mmol/L，硫酸镁1.2 mmol/L，pH 7.4)中，去除动脉周围脂肪组织后将血管剪成3～4 mm的血管环。分别用各组循环微粒(3 mg)孵育血管环30 min后用1×10-6mol/L苯肾上腺素(美国Sigma公司，批号：59-42-7)收缩血管至平台期，而后依次加入浓度为1×10-7mol/L至1×10-4mol/L的乙酰胆碱(美国Sigma公司，批号：60-31-1)，每个浓度干预2 min。将血管环连接至BL-420E+生物机能试验系统(中国成都泰盟科技有限公司)进行血管舒张功能检测。血管舒张率=(苯肾上腺素孵育后血管张力-循环微粒孵育后血管张力/苯肾上腺素孵育后血管张力)×100%。

1.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0作图，采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组内比较采用配对t检验，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组和ASTEMI组溶栓前后循环微粒含量的比较 对照组循环微粒含量为(3.02±0.72)mg/mL，ASTEMI组溶栓前、溶栓2 h后循环微粒水平分别为(4.16±1.65)mg/mL、(5.12±1.43)mg/mL。ASTEMI组溶栓前循环微粒含量高于对照组(t=2.832，P=0.007)，ASTEMI组溶栓2 h后循环微粒含量高于溶栓前(t=2.147，P=0.012)。

2.2 3组大鼠心肌组织中的eNOS、iNOS表达水平的比较 动物对照组、实验1组、实验2组大鼠心肌组织中的eNOS表达水平依次降低，iNOS表达水平依次升高(均P<0.05)，见表2、图1和图2。

动物对照组 实验1组 实验2组

动物对照组 实验1组 实验2组

2.3 3组大鼠血管舒张功能的比较 动物对照组、实验1组、实验2组大鼠的血管舒张率依次降低(均P<0.05)，见表2。

表2 3组大鼠心肌组织中的eNOS、iNOS表达水平和血管舒张率的比较(x±s)

3 讨 论

ASTEMI因其高致死率而受到广泛关注和重视，目前针对ASTEMI患者最有效的血运重建方法是PCI，然而众多基层医院尚无开展PCI的条件，且部分患者或家属对PCI存在抵触心理。因此，溶栓治疗仍然是有效改善ASTEMI患者预后不可或缺的措施。但是，溶栓后冠状动脉缺血再灌注所致的心律失常等情况仍然是困扰广大医疗工作者的一大问题[8]。缺血再灌注所致的各种自由基(如烷自由基、烷氧自由基、烷过氧自由基等)、血管活性物质(如白三烯、血小板激活因子等)、内皮素和血管紧张素等[9]有可能引起循环微粒数量和功能的改变。而循环微粒已被证实可导致内皮功能障碍和自由基失衡，内皮功能障碍和自由基失衡又可以刺激循环微粒产生，进而形成恶性循环[3，10]。本研究结果显示，与健康志愿者比较，ASTEMI患者体内循环微粒含量升高(P<0.05)，而溶栓可使ASTEMI患者体内循环微粒水平进一步升高(P<0.05)，说明循环微粒可能参与了溶栓后冠状动脉缺血再灌注损伤的发生和发展。

eNOS作为正常情况下内皮细胞产生一氧化氮的主要蛋白酶，是维持血管收缩和舒张稳定的主要物质。iNOS在正常情况下不表达，只有在机体受到各种刺激下才会大量表达，大量表达的iNOS会诱导机体产生大量的一氧化氮，过多的一氧化氮与体内的自由基结合产生氢氧根离子和亚硝酸根离子，这些产物对内皮细胞和内皮功能的损害更大[11]。而正常浓度的一氧化氮对血管是有益的，可以舒张血管、促进血管新生等。研究显示，冠心病患者体内的循环微粒能够通过抑制离体大鼠血管内皮细胞产生一氧化氮而损害内皮依赖的血管舒张功能[6]。本研究显示，动物对照组、实验1组、实验2组大鼠心肌组织中的eNOS表达水平依次降低，iNOS表达水平依次升高，血管舒张率依次下降(均P<0.05)。这说明ASTEMI患者体内的循环微粒可刺激大鼠心肌组织中iNOS的表达，同时抑制大鼠心肌组织中eNOS的表达和胸主动脉的内皮依赖性血管舒张功能，而溶栓后循环微粒的上述作用较溶栓前进一步强化。溶栓后循环微粒的上述作用可导致氢氧根离子和亚硝酸根离子的大量产生，进而损害内皮功能，这也许是冠状动脉缺血再灌注发生和发展损伤的机制之一[12]。

综上所述，ASTEMI患者体内循环微粒数量增加，导致iNOS过表达而eNOS表达下调，从而引起血管舒张功能障碍，而溶栓治疗导致循环微粒数量进一步增加及其上述作用增强，这可能是溶栓后发生冠状动脉缺血再灌注损伤的机制之一。然而由于本研究将人体来源的循环微粒注入大鼠体内，存在种属差异所致的免疫源因素，因此今后仍需要更多的基础和临床研究进一步验证本研究结果。