右美托咪定对乳腺癌细胞生物学特性及糖类抗原Tn表达的影响▲

阮志平 林多茂 史鲁云

(1 北京市朝阳区妇幼保健院麻醉科，北京市 100000,电子邮箱：et3842lzqx326@163.com；2 首都医科大学附属北京安贞医院，北京市 100000)

2020年女性乳腺癌首次取代肺癌，成为全球新发病例数最多的癌症[1]。手术是治疗乳腺癌的主要手段之一。而麻醉是乳腺癌患者手术治疗过程中的一部分，其是否会影响患者的转归和预后，是否可以在手术时有针对性地选择使用或者避免使用一些麻醉方法和麻醉药物，以减少对乳腺癌患者的不利影响，甚至减少乳腺癌患者术后的转移和复发，一直是麻醉医生关注和研究的问题。右美托咪定作用于脑干蓝斑核内的α2肾上腺素受体，从而发挥镇静催眠的作用，并通过作用于蓝斑和脊髓的α2肾上腺素受体，从而发挥镇痛作用；同时其可降低交感神经的活性、抑制去甲肾上腺素释放，从而起到降低血压的作用[2]。由于右美托咪定具有一定优势，如产生类似自然睡眠效果、易唤醒、呼吸抑制作用较弱、减轻应激反应、减少阿片类和麻醉药物用量等，自上市以来得到了广泛的使用。而且，由于其独特的药理学特性，欧美国家的一些研究将右美托咪定应用于美国食品药品管理局规定以外的范围，如儿科及神经外科[3]。右美托咪定可抑制胰腺癌[4]、肝癌[5]等肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，且目前已有研究表明右美托咪定可减少乳腺癌患者认知功能障碍的发生,并减轻免疫反应[6]，但其对乳腺癌细胞生物学特性影响如何，有待进一步研究。

糖类抗原Tn最早于20世纪60年代被发现，在卵巢癌、肺癌等多种肿瘤中均有表达，且已被证实与肿瘤的不良预后密切相关[7]。Tn是一种细胞间黏附的抑制因子，在体内具有促进细胞迁移、诱导细胞增生、抑制细胞间黏附的作用，是一个与肿瘤侵袭有关的指标。肿瘤细胞膜上的糖脂和糖蛋白被认定为抗原(T抗原)，而Tn是T抗原的前体[8]；当细胞产生恶性变化时，细胞膜上糖脂发生糖基化或产生新糖基，从而产生Tn[9]。目前关于右美托咪定、乳腺癌细胞生物学特性与糖类抗原Tn水平三者之间的关系尚不明确。因此，本研究探讨右美托咪定对乳腺癌细胞生物学特性和糖类抗原Tn表达的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞和组织标本来源 乳腺癌MCF-7细胞购自微蒙生物科技(上海)有限公司。选择2019年11月至2020年11月于北京市朝阳区妇幼保健院治疗的5例乳腺癌患者，留取其术后乳腺癌组织和癌旁组织(距离癌组织1.5 cm)标本，立即置于液氮中保存。所有患者组织标本均经病理学诊断为乳腺癌，其中浸润性导管癌3例,导管原位癌1例,小管癌1例，术前均未接受放化疗。本研究经北京市朝阳区妇幼保健院伦理委员会批准(批号：Y2019-011-03)，患者均签署知情同意书。

1.2 实验试剂及仪器 右美托咪定(江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号：国药准字H20090248)；胎牛血清(上海极威生物科技有限公司，编号：GV-168001)；RPMI-1640培养基(南京生航生物技术有限公司，货号：BC-M-016)，完全培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150421B-HR)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂(中国艾美捷科技有限公司，货号：10009591-5)；膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)试剂(大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0220)；Transwell 小室(北京优尼康生物科技有限公司)；基质胶(广州合华科技有限公司，货号：356234)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、Tn抗体(上海沪峥生物科技有限公司，货号：HS4316、HZK-10085)；辣根过氧化物酶标记的二抗(北京博尔西科技有限公司，货号：BHR104)；细胞裂解液(上海吉至生化科技有限公司，货号：AR0020)；蛋白提取试剂(上海博湖生物科技有限公司，货号：BH-S63617)；增强型化学发光试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司，货号：ECL-P-100)；总RNA提取试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：SBJ-L0055)；反转录试剂盒(上海红荣微再生物工程技术有限公司，批号：RR036A)；实时荧光PCR试剂盒(上海沪震实业有限公司，货号：HZ-6028。)

1.3 实验仪器 酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司，型号：LD-96A)；流式细胞仪(上海三崴医疗设备有限公司，型号：FACSVia)；显微镜(南京贝登医疗股份有限公司，型号：MS60)；显影仪(济南来宝医疗器械有限公司，型号：RZC-1202)；PCR仪(南京康维达生物科技有限公司，型号：QuantStudio 3)。

1.4 细胞培养及实验分组 将乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素的高糖RPMI-1640培养基(含酚红)培养，并置于37℃、5% CO2培养箱中，隔天换液。当细胞达80%～90%融合时传代：用0.25%胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，当细胞形态变圆、连接松解时，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基终止消化，800 r/min离心5 min，重悬细胞，以一传二的比例传代，取第3～5代细胞进行实验。将第3～5代的乳腺癌MCF-7细胞以3×104个/mL接种于96孔板中，每孔200 μL，将细胞分为RX组(空白组)、YMD组(低剂量组)、YMZ组(中剂量组)、YMG组(高剂量组)，每组设置2个复孔。继续培养4 h后，在YMD组、YMZ组、YMG组的MCF-7细胞中加入20 μL的右美托咪定，使其终浓度分别为10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L，RX组细胞中加入20 μL的生理盐水，放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养，24 h后进行相关指标的检测。

1.5 检测指标

1.5.1 MTT法检测各组乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率：收集各组细胞，将密度调整为3×104个/mL后接种到96孔板中，每孔200 μL， 加入RPMI-1640培养基，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，当细胞密度达到50%时，更换培养基；再培养48 h后加 MTT 试剂，继续培养4 h后使用酶标仪测490 nm处吸光度值，并计算增殖抑制率。设立空白孔，加入无血清RPMI-1640培养基进行调零。增殖抑制率=[1-加样孔平均吸光度值/空白孔平均吸光度值]×100%。设2个复孔，实验重复3次。

1.5.2 流式细胞仪检测各组乳腺癌MCF-7细胞的凋亡情况：收集各组细胞，接种于6孔板中(2×105个/孔)，胰蛋白酶消化乳腺癌细胞后，加入RPMI-1640完全培养基终止消化；磷酸缓冲盐溶液清洗细胞后进行细胞计数，1 250 r/min离心6 min，弃上清，加入500 μL 结合缓冲液重悬。加入 5 μL Annexin V-FITC混匀、 10 μL PI混匀，室温避光孵育5～15 min，随即放入流式细胞仪检测细胞凋亡情况。设2个复孔，实验重复3次。

1.5.3 Transwell法检测各组乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力：取出冻存的Matrigel基质胶于4℃下过夜以溶胶。包被基底膜(冰上操作)，即用无血清的冷RPMI-1640培养基稀释Matrigel基质胶使其浓度最终达到200 μg/mL，取100 μL稀释胶加到24孔Transwell上室中，37℃孵育6 h。用无血清RPMI-1640培养基轻洗凝胶，以水化基底膜。消化、重悬细胞，调整细胞密度为5×106个/mL，上室加入200 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃培养箱中孵育24 h。棉签拭去上室底部膜表面的细胞。移去Transwell小室，倒置，风干。现配结晶紫，每孔加入500 μL，将小室置于25℃染色30 min，磷酸缓冲盐溶液清洗1次，晾干。显微镜下观察每个样本，连续选5个清晰视野进行计数，然后计算平均数。设2个复孔，实验重复3次。

1.5.4 Transwell法检测各组乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力：取各组MCF-7细胞并饥饿12 h后，将细胞消化、离心重悬，用无血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×105个/mL，在Transwell小室下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，Transwell小室上室加入100 μL无血清的细胞悬液，将Transwell小室置于37.2℃、5% CO2培养箱中培养16 h，4%甲醛固定小室，0.1%结晶紫溶液染色，用棉签擦去上室底部膜表面细胞后观察拍照。设2个复孔，实验重复3次。

1.5.5 实时荧光PCR检测Tn的mRNA在乳腺癌组织及细胞中的表达：取癌组织及癌旁组织标本各20 mg，将其剪碎、研磨、裂解液裂解后离心(800 r/min，5 min)，取上清液于试管中并置于-70℃冰箱中保存；收集各组乳腺癌细胞，使用胰蛋白酶消化后提取细胞悬液，冲洗，放于无菌试管中。采用TRIzol法提取组织细胞总RNA，检测浓度和纯度后将RNA反转录为cDNA。通过Primer 5.0软件设计引物，由吉林省奇健生物技术有限公司合成。Tn上游引物序列为5′-GGTACAGTGGGACAGCAGGTG-3′,下游引物序列为5′-GAGAGGATCTGCCATTGTGG-3′；内参β-肌动蛋白上游引物序列为5′-CTC CATCCT GGCCTC GCT GT-3′,下游引物序列为5′-GCTGTC ACCTTCACC GTT CC-3′。配置10 μL的反应体系(2×Green Mix 5 μL、引物混合物0.6 μL、模板1 μL、DEPC水3.4 μL)。PCR反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环40次。以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。设2个复孔，实验重复3次。

1.5.6 蛋白免疫印迹法检测各组细胞中Tn的蛋白表达：收集各组MCF-7细胞进行裂解后提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。将提取的蛋白溶液和缓冲溶液按照4 ∶1的比例进行混合后将其煮沸，使蛋白变性，以每孔上样蛋白量20 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件为浓缩胶80V，分离胶120 V。电泳后配制转印缓冲液并放入4℃冰箱内预冷，经电转印将蛋白样品转移至聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗(1 ∶150)4℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液漂洗3次，10 min/次,最后加入二抗(1 ∶1 000),常温孵育1.5 h。取出聚偏二氟乙烯膜用PBS漂洗3次，10 min/次。用增强型化学发光试剂曝光显影3 min，用ImageJ软件(北京柏奥易杰科技公司)分析条带灰度值。以GAPDH为内参，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值，即为Tn蛋白的相对表达量。设2个复孔，实验重复3次。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率和凋亡情况的比较 RX组、YMD组、YMZ组、YMG组的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均依次升高(均P<0.05)。见表1、图1。

表1 4组乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率和凋亡率的比较(x±s，%)

图1 各组细胞凋亡情况

2.2 各组乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移能力的比较 (1)YMD、YMZ、YMG组侵袭细胞数量均少于RX组，且YMZ、YMG组侵袭细胞数量少于YMD组(均P<0.05)。见表2、图2。(2)RX组、YMD组、YMZ组、YMG组迁移细胞数量依次降低(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 4组乳腺癌MCF-7细胞侵袭和迁移能力的比较(x±s，个)

图2 各组细胞的侵袭情况(×400)

图3 各组细胞的迁移能力(×400)

2.3 不同组织中Tn mRNA相对表达水平的比较 乳腺癌组织中Tn mRNA的相对表达量为2.14±0.25，高于癌旁组织的1.00±0.00(t=10.200，P<0.001)。

2.4 各组乳腺癌MCF-7细胞中Tn 的mRNA和蛋白相对表达情况的比较 RX组、YMD组、YMZ组、YMG组细胞中的Tn mRNA相对表达量依次降低(均P<0.05)。YMD、YMZ、YMG组Tn蛋白的相对表达量均低于RX组(均P<0.05)，YMZ、YMG组Tn蛋白相对表达量均低于YMD组(均P<0.05)。见表3和图4。

表3 4组乳腺癌MCF-7细胞中Tn mRNA和蛋白相对表达水平的比较(x±s)

图4 各组细胞中 Tn蛋白的表达情况

3 讨 论

乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下发生异常增殖所导致的疾病，在早期表现为乳房肿块等，晚期可因癌细胞的转移、侵袭等造成多种器官发生病变，严重威胁患者的生命健康[10-12]。乳腺癌细胞极易脱落于血液中并随着血液及淋巴液传播至全身，因此乳腺癌易发生转移[13-15]。

已有研究表明，右美托咪定对不同的肿瘤具有抑制作用。例如，罗栩伟等[16]研究发现，右美托咪定可抑制骨巨细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭；连红梅等[17]发现，右美托咪定可诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡，并可抑制其迁移能力、侵袭能力；唐瑶[18]建立了卵巢癌大鼠模型，发现给予右美托咪定干预后卵巢癌大鼠的肿瘤体积明显缩小，卵巢癌组织中的细胞出现不同程度死亡。本研究结果显示，给予右美托咪定干预后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率、凋亡率增高，侵袭、迁移细胞数量减少，且具有一定的剂量依赖性。由此可见，右美托咪定对乳腺癌的抑制作用与上述研究结果相似，不仅可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，还可有效促进乳腺癌细胞的凋亡。因此，可在乳腺癌患者的手术中应用右美托咪定，其在发挥镇痛作用的同时抑制癌细胞恶性行为，为乳腺癌的治疗提供一定的价值。

Tn是一种肿瘤标志物,其可使机体受到刺激后产生免疫应答，并与免疫应答的产物结合引发免疫效应，导致机体免疫功能异常，从而引起甲状腺炎等免疫疾病的发生[19-20]。有学者发现，糖类抗原Tn在心脏和动脉损伤、肿瘤的血管发生和肿瘤转移，以及调节干细胞活动中具有关键作用[21-22]。Tn在人类许多肿瘤组织中均呈现高表达，能够刺激肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞迁移[23]。本研究结果也显示，Tn mRNA在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织。给予右美托咪定后，乳腺癌MCF-7细胞中Tn的mRNA和蛋白相对表达水平均降低，且中、高剂量的右美托咪定干预效果更为明显(均P<0.05)。有研究显示，通过激活细胞上皮间质转化信号通路使糖类抗原Tn过表达，可以增强结肠癌细胞的侵袭能力及迁移能力[23]；而当给予糖类抗原Tn免疫佐剂或是与载体蛋白结合后，可使肿瘤细胞的增殖、扩散等受到阻碍[24]。结合上述研究结果，我们推测，右美托咪定可能是通过抑制糖类抗原Tn表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡，发挥抗乳腺癌的作用。

综上所述，右美托咪定可抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移，并促进细胞凋亡，其或通过抑制糖类抗原Tn表达而发挥抗乳腺癌的作用。