紫杉醇和姜黄素联合使用的体内外抗乳腺肿瘤效果

赵琳娜 ， 唐意念 ， 栗婷婷 ， 高嘉枫 ， 胥辉豪 ， 林珈好 , 林德贵

(中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

紫杉醇(Paclitaxel，TAX)是从红豆杉树皮中提取出的四环二萜类化合物，是红豆杉中的主要抗癌活性成分，能够从整体、器官、细胞和分子多水平治疗乳腺癌[1-2]，已于1992 年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗人卵巢癌和转移性乳腺癌。

姜黄为姜科植物姜黄(CurcumalongaL.)的干燥根茎，具有破血行气、通经止痛之功，是重要的活血化瘀类中药。姜黄的主要多酚类活性成分姜黄素(Curcumin，CUR)具有抑制多种肿瘤的功效，尤其对于治疗乳腺癌发挥着重要作用[3]。CUR已作为潜在的肿瘤化学预防剂进入临床试验早期阶段[4]。另有研究表明，CUR不仅能直接杀伤乳腺癌细胞，还具有较强的抗肿瘤多药耐药活性，能够在一定程度上逆转A2780t 紫杉醇耐药株、MCF7 紫杉醇耐药株、MNNG/HOS 甲氨蝶呤耐药株等肿瘤细胞的耐药性[5-6]，与其他抗癌药共同作用时，可增强其他药物对耐药细胞的细胞毒作用。

TAX和CUR具有协同治疗恶性肿瘤的功效。Gao等[7]研究发现，在一定浓度范围内，CUR和TAX合用能够通过促进细胞凋亡和抗肿瘤血管生成治疗结肠肿瘤，且二者合用的体内外抑癌作用优于任一单成分组。除此之外，二者合用可大大降低TAX剂量至10 nmol/L，降低TAX临床高剂量的细胞毒性风险。另有研究表明，CUR和TAX合用能够逆转TAX诱导的EGFR信号激活，并降低p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达水平，有效逆转TAX多药耐药[5]。

犬作为人类的伴侣动物，所处生活环境和接触的致癌诱因与人类极其相近，犬乳腺肿瘤在兽医临床中也属常发病，母犬乳腺肿瘤发病率约占全部肿瘤性疾病的25%～42%，其中恶性乳腺肿瘤发病率为50%，是人类乳腺肿瘤恶性率的3倍。本试验探讨了TAX、CUR联合使用的抗乳腺肿瘤作用，以期为犬乳腺肿瘤的临床治疗提供新的方法，从而推动人类和犬乳腺肿瘤研究的比较与共进。

1 材料与方法

1.1 实验动物 BALB/c小鼠30 只，清洁级，5 周龄，雌性，体重16～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 细胞株 小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。犬乳腺肿瘤细胞系7364，由本实验室临床采集培养并验证所得。

1.3 药品与试剂 TAX标准品(宝鸡市国康生物科技有限公司，纯度为99.5%)；CUR标准品(宝鸡市国康生物科技有限公司，纯度为95%)；CCK-8检测试剂盒(日本Dojindo东仁化学科技有限公司)；多普适®TAX注射液(哈药集团生物工程有限公司)。

1.4 主要仪器 81型CO2细胞培养箱(Thermo Forma公司)；LD4-2 离心机(北京医用离心机厂)；IXJ型倒置显微镜(Olympus公司)；电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DW-86 W420型-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)。

1.5 试验方法

1.5.1 CCK-8法测定细胞增殖抑制率 使用犬乳腺肿瘤细胞系7364，制备肿瘤细胞悬液，调整密度至5×104个/ mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2恒温湿度培养箱中培养36 h后，吸去孔内溶液，分别加入100 μL不同浓度的TAX(0.013、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μmol/L和25.6 μmol/L)、CUR(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L和256 μmol/L)、TAX+CUR(将浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/L和0.8 μmol/L的TAX培养基溶液，分别与浓度为0.25、0.5、1、2 μmol/L和4 μmol/L的CUR培养基溶液等体积混合，得到30 组不同浓度的TAX和CUR混合培养基溶液)培养基溶液处理细胞，各组DMSO浓度均为0.8%。空白组不接种细胞。置于培养箱中培养24 h后，吸去上清，每孔加入100 μL 5% CCK-8试剂培养基溶液。在培养箱中反应2.5 h后，使用酶标仪检测每孔吸光度，检测波长为450 nm。按照公式(1)计算各组细胞增殖抑制率。

(1)

式中对照孔为DMSO组各孔，空白孔为空白组各孔。

为进一步反映两药间的相互影响，根据参考文献[8]，分别按照公式(2)和(3)计算协同指数Q和联合指数CI。

Q=E(AB) / [EA+(1-EA)×EB]

(2)

CI=a/A+ b/B

(3)

公式(2)中E(AB)为两药合用的增殖抑制率，EA和EB分别为两药单用的增殖抑制率。公式(3)中a 为联合给药时TAX的半数抑制浓度(IC50)，b为联合给药时CUR的IC50，A为TAX单独给药的IC50，B为CUR单独给药的IC50。当CI < 1，两药协同；CI=1，两药相加；CI > 1，两药拮抗。

1.5.2 体内抗肿瘤作用 将小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1的细胞悬液浓度调整至1×107个/mL，在小鼠腹部乳区皮下接种4T1细胞，每只200 μL(含细胞数2×106个)，接种后每日观察瘤体生长状况和大小，待肿瘤体积长至100～200 mm3时开始给药。肿瘤的平均体积(mm3)=最大长度(mm)×宽度2(mm2)/2。荷瘤小鼠模型建立后，对小鼠称重并测量肿瘤大小，随机将15只小鼠分为3组，每组5只。分别设置为生理盐水组、TAX组、TAX+CUR组，每隔4 d给药1次，共给药4次。生理盐水组：每只小鼠尾静脉注射400 μL生理盐水；TAX组：给药剂量为TAX 6 mg/(kg·bw)；TAX+CUR组：给药剂量为TAX 6 mg/(kg·bw)和CUR 36 mg/(kg·bw)。给药后每隔1 d用游标卡尺量取并记录肿瘤的最大长度和宽度，计算肿瘤平均体积。最后1次给药结束后第3天处死全部小鼠，并完整剥取肿瘤，称重，按照公式(4)计算肿瘤的抑瘤率。

抑瘤率/%=(1-试验组肿瘤平均重量/生理盐水组肿瘤平均重量)×100%

(4)

2 结果

2.1 TAX对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用 结果见图1，一定浓度的TAX单体药物可抑制7364犬乳腺肿瘤细胞的增殖。随着TAX浓度的增加，其对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用增强，且较低浓度TAX便可产生较强的增殖抑制作用。由SPSS软件计算TAX对7364犬乳腺肿瘤细胞的IC50为0.191 μmol/L。此外，0.8% DMSO浓度对7364犬乳腺肿瘤细胞无显著细胞毒作用。

图1 不同浓度TAX对犬乳腺肿瘤细胞增殖抑制率曲线

2.2 CUR对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用 结果见图2，一定浓度的CUR单体药物可抑制7364犬乳腺肿瘤细胞的增殖。随着CUR浓度的增加，其对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用增强，但较低浓度的CUR几乎无增殖抑制作用。由SPSS软件计算CUR对7364犬乳腺肿瘤细胞的IC50为53.160 μmol/L。此外，0.8% DMSO浓度对7364犬乳腺肿瘤细胞无显著细胞毒作用。

图2 不同浓度CUR对犬乳腺肿瘤细胞增殖抑制率曲线图

2.3 TAX和CUR联合给药对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用 结果见表1，0.25、0.5和1 μmol/L的CUR和TAX联合时两药具有一定的协同效应。综合考虑，1 μmol/L CUR和TAX联合给药，且CUR和TAX摩尔比例较高时，两者对犬乳腺肿瘤细胞增殖抑制的协同效应较好。

表1 不同浓度TAX和CUR联合给药对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制率及两药间的相互影响

2.4 体内抗肿瘤作用 结果见图3～6。由图3可知，治疗过程中及治疗结束时，TAX+CUR组的肿瘤体积小于TAX组和生理盐水组，说明TAX和CUR联用对小鼠乳腺肿瘤有协同抑制效果。

图3 各组皮下移植瘤随时间推移体积大小变化趋势

本试验对各组在同一时间点肿瘤体积大小的差异进行了对比，由于前5次测量各组的肿瘤体积大小并无显著差异，故结果只显示了从第11 天开始各组的肿瘤体积大小差异，如图4所示，TAX+CUR组在第11 天肿瘤体积与生理盐水组有显著差异(P<0.05)，治疗结束(第17天)时，TAX+CUR组与生理盐水组和TAX组均有极显著差异(P<0.01)，且TAX组与生理盐水组相比没有显著差异(P>0.05)。结果表明低剂量TAX单药无法发挥药效。

图4 同一时间点各组间肿瘤体积变化对比

各组小鼠处死后完整剥离肿瘤的大小和重量对比结果如图5和图6所示，治疗结束时TAX+CUR组完整剥离的肿瘤小于TAX组和生理盐水组，且TAX+CUR组与TAX组的肿瘤重量有显著性差异(P<0.05)，TAX组与生理盐水组的肿瘤重量无显著差异(P>0.05)。

图5 各组小鼠完整剥离肿瘤的大小对比

图6 各组小鼠完整剥离肿瘤的重量对比

通过计算TAX+CUR组的抑瘤率为17.3%，而TAX组在此剂量下对小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1的皮下移植瘤无抑制效果。

3 讨论

紫杉醇通过与β微管蛋白的氨基末端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸位点结合，可以诱导和促进微管蛋白装配成微管，同时抑制微管解聚，稳定微管，从而导致微管的排列异常，使细胞在有丝分裂时不能正常的形成纺锤体和纺锤丝，抑制细胞的分裂和增殖，使其停滞在G2/M期，这是紫杉醇抗肿瘤作用的主要机制[9]。姜黄素与多种化疗药物具有协同效应，增强化疗疗效，还可逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药抵抗，以及增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。另有研究表明，姜黄素在抑制癌细胞的同时能保护正常细胞，而且安全性高，高剂量使用时也几乎无毒副作用[10]。在本试验细胞毒性检测中，TAX和CUR单体药物单独使用时，对犬乳腺肿瘤细胞系7364均有增殖抑制作用，其IC50分别为0.191 μmol/L和 53.160 μmol/L。而浓度范围在0.25～2 μmol/L CUR和0.013～0.4 μmol/L TAX联合给药时，TAX的IC50与TAX单独给药的IC50相比，浓度显著降低，说明TAX和CUR在一定配比、浓度条件下具有协同抗肿瘤效应。

在动物试验中，TAX的给药剂量为6 mg/(kg·bw)，低于产品说明书中该药针对乳腺肿瘤的治疗剂量(人：175 mg/m2)和大多数文献报道的TAX治疗小鼠乳腺肿瘤的试验剂量[小鼠：10 mg/(kg·bw)][11-12]，由试验结果来看，在本试验剂量下，TAX单药对荷瘤小鼠未表现出明显药效，但同等剂量下，TAX和3 mg/(kg·bw)CUR联合给药时，产生了明显的抑瘤作用，说明TAX和CUR联合用药可以对荷瘤小鼠乳腺肿瘤产生治疗效果。

TAX和CUR在一定配比、浓度条件下对犬乳腺肿瘤细胞系7364具有协同细胞毒作用，对小鼠乳腺肿瘤细胞系(4T1)皮下移植瘤具有优于同剂量单药的抑瘤效果。