金堂黑山羊传染性脓疱的病理组织学观察和病毒分子检测

向 益 ， 豆朋朋 ， 王 利 ， 魏 勇 ，俄木曲者 ， 苗 斌 ， 陈 勇

(1. 西南民族大学畜牧兽医学院 ， 四川 成都 610041 ； 2. 四川省畜牧科学研究院 ， 四川 成都 610066 ; 3. 四川省巴中市南江黄羊科学研究所 ， 四川 南江 635600)

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma，CE)，又称羊口疮，是由痘病毒科、副痘病毒属中的羊传染性脓疱病毒(Contagious ecthyma virus，CEV)引发的可感染人和反刍动物的一种接触性、嗜上皮性和增生性疾病[1-2]。CE在世界各地均广泛流行，给养殖业的发展造成严重影响。CEV可通过受损的皮肤进入宿主细胞，在表皮角质细胞中复制[3-4]，造成上皮组织损伤。该病的诊断除流行病学调查和临床症状外，通常用PCR检测确诊病原。CEVF1L基因编码病毒的囊膜蛋白，该蛋白是CEV的保护性抗原，可以刺激机体产生抗体反应，因此CEVF1L基因常用于病毒的鉴定和遗传进化分析[5]。目前，对CEV的研究大多集中在对病毒株的分离鉴定以及遗传进化分析上[6-7]，而对于CEV引起病羊的病理组织学变化，仅在杜泊羊、绒山羊和小尾寒羊上有少量报道[8-10]。金堂黑山羊为四川省成都市金堂县特产，是全国农产品地理标志，具有体型大、生长快、繁殖率高、适应性强和抗病力强等特点。2020年1月，四川成都某黑山羊场羔羊疑似感染CEV，本试验对病羊病料进行了病理组织学观察和病毒分子检测，从而为四川地区羊传染性脓疱病的诊断和致病机理研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 病料来源 四川省成都某黑山羊场羔羊突发热性传染病，全场3～6月龄羊发病率高达75%。患病羊大多出现体温升高、精神沉郁、食欲废绝，口腔和舌部出现丘疹和脓疱，唇部出现典型的“菜花样”赘生物等症状。本实验室对该羊场送检的8只病羊进行剖检，采集病羊的唇、舌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏制做病理切片，病羊的口、唇病料做病毒检测。

1.2 主要试剂 无水乙醇、PBS缓冲液，均为成都海兴化工试剂厂产品；二甲苯，天津福晨化学试剂有限公司产品；苏木素、伊红染液，均为武汉塞维尔生物技术有限公司产品；多聚甲醛，成都市科龙化工试剂厂产品；病毒基因组DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司产品；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科生物科技有限公司产品。

1.3 主要仪器 PCR仪(SimpliAmpTMThermal Cycler)和凝胶成像仪(iBright CL1000)，均为Thermo Fisher Scientific公司产品；电泳仪(DYY-6B)，北京市六一仪器厂公司产品；石蜡切片机(RM2235)，德国Leica公司产品。

1.4 方法

1.4.1 病羊剖检及病料处理 按常规病理剖检技术对送检的8只金堂黑山羊进行剖检，观察病羊各脏器剖检变化。无菌采集病羊舌部、唇部痂皮封存于液氮罐中，另从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、唇、舌切下小块组织保存于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH=7.4)备用。

1.4.2 病理组织切片制作及观察 取出经多聚甲醛固定24 h以上的病变组织，经流水缓慢冲洗24 h后，依次放入95%、90%、80%、70%乙醇中脱水，二甲苯中透明，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中浸蜡1 h，将浸蜡完成的组织包埋于包埋框中，最后切片、贴片、烤片，经H.E.染色[11]、封片，风干后于Leica显微镜下观察各组织病变特征并记录结果。

1.4.3 细菌分离培养 无菌采集8只病羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏等组织接种于LB固体培养基上，37 ℃培养48 h后观察有无菌落生长。

1.4.4 病毒基因组DNA提取 取病变口唇皮肤样品1 g，用无菌生理盐水漂洗2次剪碎后，加入5 mL PBS研磨成1∶5(W/V，g/mL)的悬液，5 000 r/min离心35 min，按照20%的比例在上清液中加入青链霉素混合液，4 ℃作用过夜，无菌检验阴性后分装，于-20 ℃保存待用，将处理过的样品进行研磨，离心后取上清液，然后按照病毒基因组DNA提取试剂盒的操作说明书提取病毒DNA，其浓度及质量于紫外分光光度计检测合格(D260 nm/D280 nm=1.8～2.0)后，于-20 ℃保存备用。

1.4.5F1L基因的PCR扩增、同源性分析及进化树构建 参考GenBank中羊传染性脓疱病毒F1L基因序列(FJ808075.1)，用Primer 5.0设计F1L基因引物(F：5′-GACCCCGAGCTCATGGT-3′，R：5′-GCCGCGTCTTCACCTGTA-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的病毒DNA为模板，PCR扩增F1L基因。PCR反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，57.5 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 2 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带并测序，结果用BLAST比对分析，利用MegAlign对该基因与14个GenBank中登录的F1L基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性比较，再利用Mega 6.0 软件构建该基因的系统进化树。

2 结果

2.1 金堂黑山羊的临床症状及剖检观察 8只金堂黑山羊出现体温升高、消瘦、被毛粗乱、精神萎靡、食欲减退或废绝等症状，其口腔、鼻腔黏稠分泌物增多；眼角分泌物增加；口、唇、舌、上颚等出现大小不等丘疹、溃疡、脓疱。病理剖检发现，金堂黑山羊胸腔积有少量淡黄色液体；心包积大量淡黄色液体，心脏质地变软、色泽变淡，表面有数量不等的出血点；肝脏肿大、淤血，表面有数量不等的出血点；脾脏肿大、淤血，质地变软；肺脏有大量出血点、肿大；肾脏表面有大量出血点，淤血、肿大；肠道内有橙红色较稀的内容物，肠黏膜有程度不等的出血点，表面附着黏稠分泌物；颈部喉气管内侧有少量黏稠液体，喉头部未见脓疱，但在靠近喉头的上颚和舌根部可见脓疱；舌部可见淡黄色黏稠分泌物、丘疹、溃疡和脓疱。

2.2 金堂黑山羊的病理组织学变化 在显微镜下观察金堂黑山羊各病理组织切片，结果显示，患病羊唇部皮肤表皮棘细胞层增厚，棘细胞发生严重的网状变性，甚至发生气球样变，一些发生坏死的棘细胞的胞核浓缩、崩解，胞浆内可见粉红色、圆形的嗜酸性病毒包涵体(图1A)；舌部皮肤表皮棘细胞层增厚，细胞肿胀，部分棘细胞空泡变性严重，甚至发生气球样变性，毛细血管扩张、充血，部分棘细胞核淡染(图1B)；心脏横纹肌细胞(心肌细胞)排列紊乱，横纹断裂、消失，成纤维细胞增多，心肌纤维肿胀，胞浆均质红染(图1C)；肝细胞水肿，胞浆空泡变性、体积增大，界限模糊，肝窦扩张、充血，肝细胞索排列紊乱(图1D)；脾周围淋巴鞘增厚，毛细血管充血，脾血窦扩张、充血，脾索紊乱(图1E)；肺泡扩张、破裂，肺泡壁变薄，肺泡和间质可见红细胞(图1F)。

2.3 细菌分离培养 将患羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏等组织接种于LB固体培养基，经37 ℃培养48 h后平板上并无细菌生长。

2.4 PCR检测及分析 以8只患病金堂黑山羊的口唇痂皮提取的病毒DNA为模板，PCR扩增CEV的F1L基因。结果显示，检测的样品均扩增出大小为230 bp的目的片段(图2)，检出率为100%。将本试验扩增的F1L基因的测序结果提交到NCBI，选取GenBank登录的国内外CEV分离株F1L基因序列与本试验的基因序列进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析。结果显示，本试验扩增的F1L基因与其他14个分离株的核苷酸同源性为95.8%～99.5%，氨基酸序列同源性为96.3%～99.6%。F1L基因系统进化树分析结果表明，本试验中扩增的F1L基因序列与GenBank的KJ610840株(湖北分离株)亲缘关系较近(图3)。

图3 F1L基因遗传进化树分析

3 讨论

羊传染性脓疱病的临床症状主要以口、鼻等出现丘疹、脓疱、增生性痂皮为主，这与羊痘病、溃疡性皮炎以及蓝舌病等相似，为确诊病原，常进行分子诊断。F1L基因是CEV的主要保护性抗原基因，且十分保守，已被广泛用于CEV分子检测、分子特征和进化分析[12-13]。尚辰等以分离毒株的DNA为模板，扩增得到1 005 bp的F1L基因，证实了从陕西地区分离的毒株为CEV，并且与新疆、甘肃等地流行的CEV亲缘关系近[14]。陈晓等提取了毒株的总DNA，并扩增得到1 023 bp的F1L基因，证实上海地区的分离株为CEV，并且与中国南方地区流行的CEV毒株亲缘关系近[15]。四朗玉珍等提取毒株的DNA，扩增得到1 062 bp的F1L基因，证实西藏地区的毒株为CEV，并且与吉林、广东地区流行的CEV株亲缘关系近[16]。本试验从金堂黑山羊病料中扩增出的F1L基因，与印度、湖北流行的CEV株亲缘关系近，这与上述结果不一致，可能与F1L基因测序位置或分离来源不同有关。

CEV感染羊只引起口唇病变最为常见，患羊首先在口角、上唇或鼻镜上出现散在的红斑，然后变为丘疹和小结节，继而发展为水疱或脓疱，最后形成增生性痂皮，影响其采食[17]。哈利等发现绒山羊感染CEV后，其右心衰竭、肺脏淤血、脾脏肿大、网胃和瓣胃黏膜出现丘疹病灶[9]。范春玲等发现小尾寒羊感染CEV后，其唇部周围痂皮下肉芽组织增生，口腔溃疡和糜烂，颌下淋巴结肿大[10]。尚辰等发现波尔山羊感染CEV后，羊口腔黏膜、齿龈、嘴唇、鼻孔等皮肤出现红斑点，而后发展为脓疱，破溃后形成疣状痂皮，剖检发现病羊心包积液、间质肺炎、颌下淋巴结肿大等病变[14]。本试验中，患病金堂黑山羊的口腔、唇、鼻腔出现严重溃疡、脓疱，并且有增生性痂皮形成，同时剖检可见，病羊肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等脏器均有不同程度的肿大、出血。这一结果与上述研究结果类似，说明金堂黑山羊感染CEV后，除造成口、唇部皮肤丘疹、脓疱等病变外，对机体实质脏器也可造成一定损伤。

CEV导致波尔山羊的组织病变主要以表皮棘细胞层为主，表现为表皮角质化、肿胀，棘层肥大和囊泡状气球样变性[17]，感染部位有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润，随着粒细胞向表皮移动并聚集在表皮的水泡内，水疱逐渐变为脓疮，部分受感染细胞的胞浆出现嗜酸性包涵体[18]。本试验中，CEV感染金堂黑山羊引起的舌部、唇部、心肌、脾脏和肺脏的组织病变与上述报道基本一致。武鑫等除了在波尔山羊的口、舌部位发现包涵体存在外，在肺脏、肝脏等部位也发现了病毒包涵体[19]，但本试验仅在金堂黑山羊的唇、舌部发现了嗜酸性病毒包涵体，这可能与病毒的复制、侵袭力有关，也可能由于地区的差异导致了病毒毒株的变异，毒力增强。

综上所述，本试验从病理组织学和病原学角度证明了引起此次金堂黑山羊患病的病原是CEV，为四川地区CEV的诊断和致病机理研究积累了资料。