多杀菌素固体缓释剂的制备及对白纹伊蚊的防治效果

王 鸿 ， 于泓潇 ， 张屿萌 ， 张雅琪 ， 邓景月 ， 赵建国 ， 韩 谦

(1. 海南大学生命科学学院 ， 海南 海口 570228 ； 2. 海南大学全健康研究院 ， 海南 海口 570228 ; 3. 海南大学药学院 ， 海南 海口 570228)

多杀菌素(Spinosad)是在刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵液中提取的一种大环内酯类化合物，经过近年的发展已经成为国际公认的新型无害杀虫剂[1]。多杀菌素在土壤中的光解半衰期为9～10 d，在水中的光解半衰期少于1 d，具有光解速度快、环境持久性风险低的特点[2]。白纹伊蚊(Aedesalbopictus)属于“半家蚊”，多滋生于居民点及其周围的各种人工积水容器中,是传播登革热的重要媒介[3]。目前就蚊幼的控制而言，基于苏云金杆菌以色列变种、球形芽孢杆菌和刺糖多孢菌的微生物杀虫剂受到了广泛的重视[4-5]。蚊虫的许多行为(如吸血、产卵和宿主搜寻等)主要受宿主动物气味物质的影响。如人体对蚊虫引诱的差异与人体汗液有关，而脂肪酸铵类物质是人体汗液的主要成分，已被证实参与影响蚊虫宿主搜寻行为[6]。均一体缓释剂指在一定温度下，将原药均匀分散在高分子聚合物中，使两者混为一体，形成固溶体、分散体或凝胶体，然后按需加工成固体形态的缓释剂型[7-8]。本试验利用十六醇、聚乙二醇和碳酸铵等材料采用物理包埋的方法搭建骨架层-缓释层制成一种具有杀灭与引诱作用的缓释块并测定其缓释性质，运用生物测定的方法测试其对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果以及对成虫的诱卵效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 多杀菌素标准品(纯度为99%，上海玛雅试剂有限公司)；聚乙二醇-1000、十六醇(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；碳酸铵(分析纯，西陇科学有限公司)；二氯甲烷、甲醇、乙腈(色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司)。

1.2 主要仪器 高效液相色谱仪(LC-20ADXR，日本岛津公司)；恒温磁力搅拌仪(GL-3250A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；氮吹仪(HSC-12B，天津恒奥科技有限公司)；超声波清洗仪(PS-40，深圳市超艺达科技有限公司)。

1.3 蚊虫饲养 白纹伊蚊由中国军事医学科学院微生物与流行病所提供。饲养条件为:温度(26±1) ℃、相对湿度60%～70%、光周期12 L∶12 D(光照∶黑暗)。

1.4 多杀菌素缓释剂的制备 将聚乙二醇-1000与十六醇按2.0 g ∶1.5 g比例置于80 ℃中恒温均匀搅拌形成骨架-缓释层，使用恒温磁力搅拌器搅拌冷却至60 ℃后，加入多杀菌素原药搅拌混匀，冷却至50 ℃后迅速倒模并于4 ℃保存备用。

按上述条件分别制成加入0.05 g和0.02 g多杀菌素原药的成品(用Spi-Block1和Spi-Block2表示)，以不含多杀菌素(用Block表示)为对照。

1.5 高效液相色谱法(HPLC)测定缓释浓度

1.5.1 色谱条件[9]色谱柱:岛津C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相:甲醇—乙腈—水(40∶40∶20)，使用前经超声混匀备用；体积流量:0.8 mL /min；检测波长:246 nm；柱温:25 ℃；进样量:10 μL。

1.5.2 标准曲线的绘制 称取多杀菌素0.01 g标准品，精确到0.000 1 g，用甲醇配成 1 mg/mL的标准溶液，使用甲醇逐级稀释为5、20、40、80 μg/mL和100 μg/mL 的梯度浓度溶液，用0.45 μm滤膜过滤后经HPLC检测，用峰面积W对浓度C(mg/mL)作线性回归，得到回归方程y=85.713x+26.544，R2= 0.999 8，成良好线性关系。

1.5.3 样品缓释浓度的测定 称取0.25 g Spi-Block1于生测杯中,加入500 mL纯水，分别取1、3、5、7 d和9 d的缓释液1 mL，同时加入0.5 mL二氯甲烷超声10 min，用氮气吹干后加入1 mL甲醇复溶，以等量多杀菌素原药作为对照，二者均设3个重复，用1.5.1的色谱条件进行测定，用1.5.2绘制的标准曲线计算出9 d缓释浓度。

1.6 多杀菌素缓释剂的快速灭蚊效果测试 选择联合国世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的幼虫浸渍法[10]来测试Spi-Block的速杀效果，在生测杯中加入25条3～4龄期的白纹伊蚊幼虫和100 mL去氯水，试验组加入Spi-Block1、Spi-Block2；对照组加入质量相同的Block；空白对照组不作处理(25条幼虫+100 mL去氯水)，每组均设3个重复，24 h内每隔3 h测定1次，记录活幼虫数目。

1.7 多杀菌素缓释剂的长效灭蚊效果测试 在生测杯中加入25条3～4龄期的白纹伊蚊幼虫和100 mL 去氯水，试验组加入Spi-Block1和Spi-Block2；对照组加入0.05 g纯多杀菌素，空白对照组不作处理(25条幼虫+100 mL去氯水)，每组均设3个重复，每周进行1次幼虫生物测定，持续4周，记录每周活幼虫数目。

1.8 多杀菌素缓释剂对白纹伊蚊诱卵试验 按照1.4的试验方法加入0.2 g碳酸铵制成带有引诱剂的Spi-lu-Block。根据WHO关于孳生地陷阱测试指南[11]进行试验设计，于40 cm×40 cm×40 cm规格养蚊笼中，在等面积范围内放置3个生测杯,试验组为用100 mL Spi-lu-Block浸出液浸润1 d的滤纸+100 mL去氯水，对照组为用100 mL Block浸出液浸润1 d的滤纸+100 mL去氯水，空白对照组为滤纸+100 mL去氯水；放入20只孕雌蚊，产卵1 d后收集滤纸，记录各组中蚊卵的数目，计算诱卵率和产卵活跃指数。

诱卵率(OR)=试验组卵数/产卵总数×100%

产卵活跃指数(OAI)=(试验组卵数-对照组卵数)/产卵总数

当OR>50%，OAI>0时，表明试验组具有诱卵作用，反之，则具有趋避作用。当OAI>0.3时，表明试验组具有显著的诱卵作用。

1.9 统计分析 对1.6中时间、幼虫死亡数、幼虫总数3个因子通过SPSS 22.0软件Regression中Probit板块计算致死中时(LT50)，对1.6、1.7中致死率数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行分析并绘图，使用GraphPad Prism 8.0软件对OR和OAI进行分析并绘图。

2 结果

2.1 多杀菌素缓释剂液相测定 结果如图1所示，缓释剂中多杀菌素出峰时间约为5.6 min，峰型良好，不受其他杂质峰影响。

图1 缓释样品液相色谱图

2.2 多杀菌素缓释剂的缓释性能 结果如图2所示，纯多杀菌素9 d最大溶出率为37.39%，且在第5天达到最大，无缓释规律；缓释剂中多杀菌素7 d平均缓释率为14.54%(P<0.01)；重复试验之间无显著差异(P=0.126)。

图2 缓释剂中多杀菌素与纯多杀菌素释放曲线

2.3 缓释剂的杀灭与引诱效果

2.3.1 快速灭蚊效果测试 24 h幼虫毒力测试结果如图3所示，对照组没有出现死亡数，与试验组存在极显著差异(P<0.01),不同剂量的多杀菌素缓释剂之间的灭杀效果存在极显著差异(P<0.01)，重复试验之间无显著差异(P=0.955)。

图3 不同剂量多杀菌素缓释剂的快速灭蚊效果

2种缓释剂对白纹伊蚊幼虫的致死中时如表1所示，缓释剂与空白对照间的致死中时有显著差异(P<0.05)；缓释剂之间致死中时无显著差异(P=0.963)。

表1 2种不同剂量缓释剂对白纹伊蚊幼虫的致死中时

2.3.2 长效灭蚊测试 多杀菌素缓释剂1个月长效灭蚊效果测试结果如图4所示，多杀菌素原药对照组在第4周灭蚊效果突降，1个月平均灭蚊率为81.33%，2种多杀菌素缓释剂的1个月平均灭蚊率分别为95.33%和86.80%；Spi-Block1组灭蚊率与对照组相比有显著差异(P<0.05)；Spi-Block2组则受剂量因素影响与对照组无显著差异(P=0.566)。

图4 多杀菌素缓释剂1个月长效灭蚊效果

2.3.3 引诱作用 结果如图5所示，在白纹伊蚊孕蚊对试验组和对照组的产卵偏好选择时，试验组的平均OR为83.71%，对照组仅为32.45%，试验组OAI为0.68，与对照组相比具有极显著的诱卵效果(P<0.01)。

图5 多杀菌素缓释剂的诱卵效果

3 讨论

目前，关于多杀菌素缓释剂型的研究多以悬浮剂和微球制剂为主，其中多以高分子化合物作为辅料包埋药物以达到控释目的。Xu等以壳聚糖为载体制成多杀菌素微球缓释剂[12]；Li等采用壳聚糖共沉淀法包埋多杀菌素进行控释[13]；Cheng等制备多杀菌素与碳酸铵复合微球防治沙棘绕实蝇成虫[14]；Huang等以聚脲异氰酸酯为壁材制备6%呋喃威-多杀菌素微囊悬浮剂[15]。而多杀菌素的毒力作用研究则以小菜蛾、蚜虫等农业害虫为主，针对蚊虫等媒介昆虫的研究还尚不充分[16-18]。本试验制备的缓释片剂契合了白纹伊蚊容器型小水体的孽生习性且方便使用。选择碳酸铵作为引诱剂集中蚊虫进行杀灭，可用于家庭、养殖场等环境防治白纹伊蚊。采用十六醇和聚乙二醇组成的缓释层延长了多杀菌素在水体中的释放时间，达到了长控缓释的效果，但聚乙二醇在高温潮湿的环境下会发生消融，后期将会优化辅料与药物比例提高稳定性与短控缓释效果。