鸭源大肠杆菌的分离鉴定及致病性分析

董洪燕，宋海港，朱善元，于圣青，谢 军，洪双鹏，郭长明，徐 海，高月秀

(1.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300；2.扬州大学兽医学院，扬州 225009；3.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

禽致病性大肠杆菌(APEC)是禽大肠杆菌病的主要病原，可引起禽类的气囊炎、肝周炎、心包炎等症状，也是导致水禽业经济损失的重要原因之一[1]。近年来，随着水禽业的快速发展，养殖规模迅速扩大和增加，鸭源大肠杆菌病的发生也日益频繁和复杂，且其血清型众多，常引起继发性感染，从而给该病的防控带来巨大的困难[2-3]。禽致病性大肠杆菌含有多种毒力因子，其致病性由多种毒力基因协同作用[4]，目前鸡源的毒力因子检测研究较多，鸭源的较少[5]。此外，经相关研究表明，特定的O抗原与大肠杆菌的致病性有关[6]，同时血清型与菌株所携带的毒力基因也存在一定关系[7-8]。因此，加强鸭源大肠杆菌病的监测与致病性分析，对养鸭场的健康发展以及研究鸭源大肠杆菌的血清型、毒力基因与致病性之间的相互关系具有重要意义。本研究从江苏、江西以及安徽地区不同养鸭场病死鸭的病料中分离鸭源大肠杆菌，对其进行生化和血清型鉴定、毒力基因检测、雏鸭致病性试验，并对毒力较强的菌株进行生长曲线以及半数致死量(LD50)测定，为鸭源大肠杆菌的防控以及致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病料采自江苏、江西、安徽地区不同养鸭场病死鸭的心脏、肝脏、肾脏等脏器，共采集293份病料，其中江苏95份，江西110份，安徽88份。300只7日龄樱桃谷鸭购自泰州丽佳禽业有限公司。0.45%氯化钠、GN生化鉴定卡购自梅里埃公司；2×ESTaqMaster Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker购自TaKaRa公司；LB培养基、MH培养基和麦康凯培养基均购自北京陆桥公司；GelRed染剂购自Biotium公司；大肠杆菌O1、O2、O18和O78单因子诊断血清均购自SSI公司。

1.2 方法

1.2.1 鸭源大肠杆菌的分离鉴定 无菌采取病死鸭心脏、肝脏、肾脏等脏器组织划线接种于麦康凯鉴别培养基中，37 ℃培养18～24 h，观察菌落形态，再挑取疑似菌落分别转接于LB培养基，37 ℃，200 r/min培养18～24 h，运用全菌裂解法[9]提取细菌DNA。参照文献[1]设计大肠杆菌鉴定引物(表1)，对分离菌株进行PCR鉴定，PCR结果经北京擎科生物科技有限公司测序，在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。

1.2.2 生化鉴定 将分离到的菌株划线接种于LB平板中，37 ℃培养18 h后，用0.45%氯化钠调成0.50～0.62个麦氏比浊度的菌悬液，再将菌悬液和GN生化鉴定卡片放于VITEK微生物生化鉴定仪中进行鉴定。

1.2.3 O血清型鉴定 参照文献[6]中大肠杆菌血清型鉴定引物(表1)以及PCR方法对鸭源大肠杆菌分离株的血清型进行初步鉴定，鉴定为阳性的分离株再进行玻板凝集试验验证[1]。

1.2.4 毒力基因检测 根据相关文献[4]设计18种毒力基因的检测引物(表1)。引物均由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成。 PCR反应体系20 μL：2×Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

表1 引物信息

1.2.5 雏鸭致病性试验 取300只7日龄健康樱桃谷鸭随机分成74个试验组及1个对照组(4只/组)，将新鲜培养的74株鸭源大肠杆菌分离株菌液浓度调至108CFU/mL。 试验组按0.1 mL/只腹腔注射菌液，对照组注射等量PBS后隔离饲养，观察记录发病及死亡情况直至第7天。死亡鸭及时剖检并做细菌分离培养及PCR检测。

1.2.6 生长曲线测定 挑取毒力较强以及2株毒力较弱分离株的单个菌落分别接种于10 mL LB培养基中，37 ℃培养过夜；将细菌悬液按照1∶100的比例接种至100 mL LB培养基，37 ℃ 200 r/min摇振培养，每隔1 h取200 μL细菌悬液测D600 nm值，连续12 h，进行生长曲线测定。

1.2.7 LD50测定 选取毒力强的鸭源大肠杆菌分离株，根据D600 nm值将细菌浓度调至109或108CFU/mL，10倍倍比稀释至106或105CFU/mL进行LD50测定，再根据毒力强的鸭源大肠杆菌分离株的数量，将7日龄樱桃谷鸭随机分组，每组8只，每只腹腔接种0.1 mL菌液(对照组接种等量的PBS)，感染后观察7 d，记录雏鸭的死亡情况，并根据Reed-Muench方法[10]计算LD50。

1.3 数据统计

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。本研究中生长曲线试验进行双尾独立T检验，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 鸭源大肠杆菌分离鉴定

根据临床症状共收集293份样品，其中74份样品在麦康凯培养基上生长出粉红色、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落；74株分离株经特异性PCR鉴定，均扩增出720 bp的目的条带(部分结果见图1)，与预期片段大小一致。测序比对结果初步表明，74株分离株均为大肠杆菌。生化试验结果表明，这些菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖产酸产气；吲哚、MR实验均为阳性；枸橼酸盐、VP为阴性；不产生H2S。说明分离到了74株大肠杆菌，总检出率为25.26%，其中江苏、江西以及安徽地区检出率分别为45.26%、17.27%和13.64%。

M,100 bp DNA Marker;1～22，部分分离株;23,阳性对照;24,阴性对照M,100 bp DNA Marker;1-22,Partial isolates;23,Positive control;24,Negative control图1 部分分离菌株PCR鉴定Fig.1 PCR identification of partial isolates

2.2 鸭源大肠杆菌血清学鉴定

74株鸭源大肠杆菌分离株经O血清型鉴定结果显示，目的片段为263、355、459、623 bp的菌株分别有1、2、2、4株(图2)，再通过玻板凝集实验进行验证，与PCR结果一致；剩余65株分离株因血清交叉凝结严重暂未定型。以上结果表明，O1血清型菌株为1株，占1.35%；O2血清型菌株为2株，占2.7%；O18血清型菌株为2株，占2.7%；O78血清型菌株为4株，占5.4%。

2.3 鸭源大肠杆菌毒力基因检测

对74株鸭源大肠杆菌分离株进行18种毒力基因检测，结果显示，ibeB和yijp基因的检出率最高，均为97.3%(72/74)；OmpA、mat、iucD和fimC基因的检出率分别为95.95%(71/74)、90.54%(67/74)、78.38%(58/74)和77.03%(57/74)；papC、vat、cva/cvi和chuA基因均只有1个菌株检测为阳性结果，检出率均为1.35%(1/74)(图3)，表明74株分离株毒力基因谱分布广泛。

74株分离株均含有2种或者2种以上的毒力基因，最高可携带13种毒力基因，其中携带6种毒力基因的细菌数为26株，携带7种毒力基因的细菌数有18株(图4)。

M,100 bp DNA Marker;1,O1血清型菌株;2、3,O2血清型菌株;4、5,O18血清型菌株;6～9,O78血清型菌株M,100 bp DNA Marker;1,Serotype O1 isolate;2 and 3,Serotype O2 isolates;4 and 5,Serotype O18 isolates;6-9,Serotype O78 isolates图2 鸭源大肠杆菌分离菌株O血清型鉴定结果Fig.2 Identification of the serotype O of Escherichia coli isolates from ducks

图3 74株鸭源大肠杆菌携带毒力基因统计结果Fig.3 Distribution of virulence genes in 74 strains of Escherichia coli isolates from ducks

图4 毒力基因分布情况Fig.4 Distribution of 18 virulence genes

2.4 鸭源大肠杆菌致病性测定

74株鸭源大肠杆菌使用107CFU/只的剂量腹腔接种7日龄健康非免疫樱桃谷鸭，雏鸭感染后，接种了分离株2019JS001和2019JS009的雏鸭于24 h开始出现精神萎靡，食欲减退，不愿饮水，逐渐消瘦，嗜睡，排黄白色粪便等症状，随后部分雏鸭出现死亡；剖检可见肝脏肿大，呈青铜色，部分雏鸭肝脏与心脏都有黄白色纤维素性渗出物，腹膜炎，腹部有渗出物，对照组雏鸭各方面均正常。各试验组雏鸭感染鸭源大肠杆菌分离株后均有不同程度的发病，其中2株鸭源大肠杆菌(2019JS001、2019JS009)感染鸭的死亡率≥50%，说明其毒力较强。另外2株鸭源大肠杆菌分离株2019JS002、2019JS010感染鸭后，其症状较轻，死亡率为0，说明其毒力较弱。

2.5 生长曲线测定

将毒力较强的分离株2019JS001、2019JS009株以及2株毒力较弱分离株2019JS002、2019JS010经连续12 h生长曲线测定发现，其生长曲线均呈上升趋势，且毒力较强和较弱分离株生长速度之间差异均不显著(P>0.05)(图5)，说明分离株2019JS001、2019JS009株的毒力较强与生长速度快慢无关。

同一时间不同菌株相比，无*，差异不显著(P>0.05)Compared with different strains at the same time,no*，no significant difference (P>0.05)图5 4株鸭源大肠杆菌的生长曲线图Fig.5 The growth curve of 4 strains of Escherichia coli isolates from ducks

2.6 LD50测定

将菌株2019JS001、2019JS009培养至对数生长期，分别用PBS稀释至最终接种剂量分别为108、107、106、105、104CFU和 109、108、107、106、105CFU，每个剂量分别接种8只雏鸭观察7 d后，计算LD50分别为104.75和107.375CFU。

3 讨 论

近期来，在水禽养殖过程中鸭源大肠杆菌引起的继发性疾病较多，形势严峻复杂[11]。本研究根据临床症状共采样293份，通过PCR以及生化鉴定出74株鸭源大肠杆菌，总检出率为25.26%，其中江苏、江西以及安徽地区检出率分别为45.26%、17.27%和13.64%。

大肠杆菌血清型众多，主要分为O、K、H、F 4种抗原，其中O抗原至少有173种[12]。中国西南地区以O76、O78、O92、O93为优势血清型[13]；山东部分地区以O2、O21、O73、O78、O83、O119、O139血清型为主[14]；广东地区优势血清以O2、O20、O78、O86、O65为主[15]；因此不同地区的血清型具有地方特异性。国内外有研究表明，其中有50%的禽致病性大肠杆菌暴发病例主要与血清型O1、O2、O18、O78有关[6]。因此，本研究74株鸭源大肠杆菌主要对这4种血清型进行鉴定，结果表明O1血清型有1株，O2和O18血清型各2株，O78血清型有4株；其余菌株因大肠杆菌血清交叉凝结现象较严重，均未定型。

毒力基因是致病菌引起机体发病的重要因素，目前发现大肠杆菌的毒力基因主要包括黏附素、侵袭素、溶血素、铁摄取系统、抗血清存活因子和空泡形成毒素等[16]。本研究74株分离株中，97.3%的菌株均检测出侵袭性相关基因ibeB和yijp，这两个基因是大肠杆菌侵袭脑血管内皮细胞相关的细菌毒力因子[17]，其次是OmpA基因(抗血清存活因子)和mat基因(黏附相关基因)，检出率均>90%，iucD基因(摄铁系统相关基因)和fimC基因(黏附相关基因)均>75%，这与福建[1]、河南[3]、河北[18]等地检出的主要毒力基因不同，表明鸭源大肠杆菌流行的地区不同，携带的主要毒力基因也存在差异。74株分离株有12种毒力基因谱，其中携带6种和7种毒力基因的占59.46%，最高的携带13种毒力基因。由于禽致病性大肠杆菌毒力因子组成复杂，并且相互作用导致该病的暴发，因此，加强对鸭源大肠杆菌毒力基因的监测具有重要意义，有助于大肠杆菌病的防控，并且降低该病对水禽养殖业的危害。

雏鸭致病性试验表明，74株分离株均有不同程度的致病性，经107CFU/只攻毒后，仅有2株大肠杆菌(2019JS001，2019JS009)感染鸭的死亡率≥50%，与李迎晓等[3]研究中的分离株致病性鉴定结果不同，这可能与不同地区分布不同以及血清型为O1、O2、O18、O78菌株较少有关[6]。随后对2019JS001和2019JS009株进行LD50测定，其分别为104.75和107.375CFU，同时这2株分离株均为非O1、O2、O18、O78血清型菌株，18种毒力基因中分别鉴定出12和11种毒力基因谱，都携带tsh、mat、fimC、ibeB、yijp、OmpA、neuC、iss、iron和iucD基因，这与其他研究[19-20]表明致病性大肠杆菌的致病性与毒力基因密切相关，且毒力较强的菌株均携带4个以上毒力基因的结果一致。因此，加强对鸭源禽致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因谱以及致病性的监测，可以对该病的预防控制以及研究三者之间的相互关系奠定基础。

4 结 论

本研究根据临床症状共采样293份，通过PCR以及生化鉴定出74株鸭源大肠杆菌；其中O1、O2、O18和O78血清型分别有1、2、2和4株，其余菌株因大肠杆菌血清交叉凝结现象较严重，尚未定型；74株分离株有12种毒力基因谱，其中携带6和7种毒力基因占59.46%，最高携带13种毒力基因；动物致病性试验表明，经107CFU/只攻毒后，74株分离株均引起雏鸭不同程度发病，但仅有2株分离株毒力较强，其LD50分别为104.75和107.375CFU。