Kras、Braf基因突变联合检测在结直肠癌中的意义与价值研究

劳景茂 韦小波 刘广 邓伟

摘要：目的：对结直肠癌中联合检测Kras、Braf基因突变的意义和价值进行研究分析。方法：收集在我院行结直肠癌手术患者切除标本80例，对DNA进行提取后采用突变扩增阻滞技术检测Kras、Braf基因突变的状态，并对基因突变和临床特征的相关性加以分析。结果：KRAS基因突变率为 50.00%（40/80）， BRAF基 因 突 变 率 为5.00%（4/80），BRAF基因突变共4例，与 KRAS 存在共同突变情况;突变最多的是2号外显子，占比为80.00%（32/40），12 密码子G12S/G12D在KRAS基因2号外显子中的突变最为常见，共17例，占比为53.13%（17/32）;KRAS基因突变合并BRAF的突变类型中，2号外显子上G12S、G12D的合并BRAF例数是最多的;与KRAS基因突变率存在显著正相关的是肿瘤部位、肿瘤浸润深度;近端结肠患者KRAS 突变率明显高于远端结肠癌和直肠患者（P<0.05）;浸润深度为T4的患者KRAS基因突变率显著高于浸润深度为T1～3患者（P<0.05）;BRAF基因突变与肿瘤浸程度、分化程度有显著相关性;浸润深度为T4的患者BRAF基因突变率显著高于浸润深度为T1～3的患者（P<0.05）;低分化肿瘤患者BRAF基因突变率显著高于中、高分化组（P<0.05）。结论：结直肠癌患者的Kras基因突变率高，其Braf基因突变均与结直肠癌的发生发展之间存在相关性。

关键词：结直肠癌;Kras基因;Braf基因;突变;价值

结直肠癌 （Colorectal Cancer， CRC） 发生于结肠和直肠中，是一种常见的消化道恶性肿瘤。作为结直肠癌常规治疗方法之一的化疗已经遇到了一定的困境和瓶颈，且越晚治疗预后越差，但是结直肠癌目前还没有确切的肿瘤标志物来进行早筛，肠镜筛查又因为耐受性问题而无法普及，因此找到结直肠癌的肿瘤标直肠已经成为了医学界广泛关注的研究热点之一。近年来，有研究发现，某些基因突变是导致结直肠癌发生、发展的根本原因，认为KRAS和BRAF基因突变与抗EGFR靶向治疗之间的效果存在紧密相关性，抗EGFR靶向治疗得到较好效果的患者大部分是KRAS和BRAF基因野生型[1～3]。基于此，本研究对结直肠癌中联合检测Kras、Braf基因突变的意义和价值进行研究分析。

1一般资料和方法

1.1 一般资料

收集2018年9月～2021年9月在我院行结直肠癌手术患者切除标本80例，其中男56例、女24例，年龄34～78岁，平均（63.24±10.34）岁。所收集的标本均经病理学检验确诊，且资料完整。

1.2 试剂与仪器

采购自厦门艾德的试剂盒，包含了石蜡包埋组织 DNA提取试剂盒及人类 KRAS/ BRAF基因突变检测试剂盒;采购自美国Thermo fisher scientific公司的 Thermo Nano Drop 2000c超微量紫外分光光度计;采购自德国安捷伦的Mx3 000P荧光定量PCR仪。

1.3 方法

1.3.1 石蜡切片样品病理评估

对组织样本进行连续切片。选择一块较为清晰的组织切面进行观察，利用苏木精和伊红试剂进行染色和评估，将切片放在显微镜下，用不同倍数进行观察。

以低倍镜视野下对该切片的观察情况作为标准进行分析，标记还没有肿瘤侵犯部分出现的部分;细胞计数可以在高倍镜视野下完成，原则上要对每个标本中的五个视野左、右、中、上、下加以保证。然后在每个视野中对30个完整细胞加以连续计数，取其中的总和和平均数，如果平均肿瘤细胞达到超10%百分之十，则表示病理学承认该样本可用。

1.3.2 石蜡切片组织基因DNA提取

对样品进行苏木精-伊红的染色。从其余切片中刮取肿瘤组织，放入1.5 ml的EP试管中，进行常规的脱蜡处理后，再采用手工-柱提取法严格按照提取盒的说明进行操作。用紫光分光光度计对所提取的DNA进行纯度和浓度的检测，所需达到的要求为1.8～2.0之间的纯度A280/A260比值，使浓度达到3.0 ng/?l。

1.3.3 突变扩增阻滞系统技术（Amplification Refractory Mutation System， ARMS）-PCR反应

操作过程严格按照KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA 基因突变检测试剂盒说明书中的内容进行。

PCR 反应参数如下：95℃ 5 min，1个循环;95℃ 25 s，64℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环;93℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环。

在第三阶段操作进行到60℃时对羟基荧光素（FAM）和5-六氯荧光素氨基磷酸酯 （HEX）通道信号加以收集，判读和分析遵循试剂盒说明书的判读原则，并分析结果。每次反应都对阳性和阴性对照加以设置以确保结构準确度。

1.4 统计学处理方法

数据处理采用SPSS23.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料用比率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 KRAS、BRAF基因突变情况

KRAS基因突变率为 50.00%（40/80）， BRAF基 因 突 变 率 为5.00%（4/80），BRAF基因突变共4例，与 KRAS 存在共同突变情况。见表1。

2.2 KRAS基因突变类型和频率

突变最多的是2号外显子，占突变的80.00%（32/40），12密码子G12S/G12D在KRAS基因2号外显子中的突变最为常见，有17例，占53.13%（17/32）。KRAS基因突变合并BRAF的突变类型中，2号外显子上的G12S，G12D的合并BRAF的的例数是最多的。见表2。

2.3 KRAS、BRAF基因突变情况与临床病理特征的关系

与KRAS基因突变率存在正相关是肿瘤部位、肿瘤浸润深度，近端结肠患者的KRAS 突变率明显高于远端结肠癌和直肠患者 （P<0.05）。在浸润深度为T4的患者中，KRAS基因突变率显著高于浸润深度为T1～3的患者（P<0.05）;BRAF 基因突变与肿瘤浸程度、分化程度有显著相关性;在浸润深度为T4的患者中，BRAF 基因突变率显著高于浸润深度为T1～3的患者（P<0.05）。在低分化肿瘤患者中，BRAF基因突变率显著高于中、高分化组（P<0.05）。见表3。

3讨论

Kras是一种鼠类肉瘤病毒癌基因，ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有3种，即H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。K-ras因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关，当正常时能控制调控细胞生长的路径;发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭;它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变[4]。

本研究发现，KRAS基因突变率为50.00%（40/80），BRAF基因突变率为5.00%（4/80），BRAF基因突变共4例，与KRAS存在共同突变情况;与KRAS基因突变率存在正相关的是肿瘤部位、肿瘤浸润深度呈现;近端结肠患者KRAS 突变率明显高于远端结肠癌和直肠患者 （P<0.05）;浸润深度为T4的患者KRAS基因突变率显著高于浸润深度为T1～3的患者（P<0.05）。

NRAS基因是RAS基因家族的一员，其编码的N-ras蛋白在RAS-RAF-MEK-ERK通路中扮演著非常重要的角色，主要是负责整个细胞循环周期和基因转录活动，和细胞增殖有着密切的关系，该基因一旦发生致病性突变就会引起细胞增殖失控，从而形成肿瘤[5]。本研究发现，BRAF基因突变与肿瘤浸程度、分化程度显著相关性;浸润深度为T4的患者BRAF 基因突变率显著高于浸润深度为T1～3的患者（P<0.05）;低分化肿瘤患者BRAF 基因突变率显著高于中、高分化组（P<0.05）。

综上，结直肠癌患者Kras基因突变率高，其Braf基因突变均与结直肠癌的发生发展之间存在相关性。

参考文献

[1]郑荣寿，孙可欣，张思维，等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志，2019，41（1） ：19-28.

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[3]刘梅，张维，张国龙，等.KRAS基因检测与西妥昔单抗一线治疗转移性结直肠癌的成本—效用分析[J].中国新药杂志，2018，27（24）：2969-2976.

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