自噬相关基因与膀胱癌预后生存分析

韩文凯,许晓燕,李丹霞,车铠,焦伟,牛海涛

[摘要]目的   探究自噬基因與膀胱癌预后的相关性。方法  从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中获取膀胱癌组织与瘤旁组织差异表达的自噬相关基因（DEARGs），对DEARGs进行生物学功能分析，筛选与生存相关的自噬基因，并构建风险模型，利用模型预测膀胱癌病人的生存状态;同时利用外部数据集验证模型的准确性，并判断模型的稳定性;最后验证该模型是否可以作为膀胱癌预后的独立因素。结果   对430例样本的转录组数据进行差异表达分析，获得了37个DEARGs（|logFC|>1，FDR<0.05）。DEARGs的生物学功能主要富集于自噬功能和癌症相关通路。模型预测结果显示，高风险组3年生存率为41.4%（95%CI=0.334～0.513），低风险组3年生存率为57.7%（95%CI=0.490～0.679）。外部数据集验证显示，模型具有稳定的预测性，高风险组3年生存率为31.6%（95%CI=0.3167～0.499），低风险组3年生存率为64.6%（95%CI=0.436～0.665），且该模型风险评分可以作为膀胱癌预后的独立因素。结论   自噬基因与膀胱癌的预后生存相关。

[关键词]膀胱肿瘤;自噬基因;比例危险度模型;癌症基因组图谱

[中图分类号]R737.14

[文献标志码]A

[文章编号]2096-5532（2022）04-0475-05

doi： 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.104[HT]

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220622.1558.003.html;[JY]2022-06-2410：59：34

AN ANALYSIS OF AUTOPHAGY-RELATED GENES AND THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE IN BLADDER CANCER

HAN Wenkai， XU Xiaoyan， LI Danxia，  CHE Kai， JIAO Wei， NIU Haitao

（Department of Medicine， Qingdao University， Qing-

dao 266071， China）

[ABSTRACT]] Objective   To investigate the relationship between autophagy genes and the prognosis of bladder cancer.

Methods The differentially expressed autophagy-related genes （DEARGs） in bladder cancer tissues and paracancerous tissues were obtained from The Cancer Genome Atlas. The biological functions of the DEARGs were analyzed to screen for survival-related autophagy genes and to construct a risk model to predict the survival status of bladder cancer patients. The accuracy of the model was validated using an external dataset and the stability of the model was judged. Finally， the model was validated as an indepen-

dent factor for predicting bladder cancer prognosis.

Results The differential expression analysis of the transcriptomic data from 430 samples resulted in 37 DEARGs （|logFC|>1， FDR<0.05）. The biological functions of the DEARGs were mainly concentra-

ted on autophagic function and cancer-related pathways. The model predictions showed that the 3 year survival rate was 41.4% （95%CI=0.334-0.513） for the high-risk group and 57.7% （95%CI=0.490-0.679） for the low-risk group. The external dataset demonstrated a stable predictive validity of the model， with a 3 year survival rate of 31.6% （95%CI=0.3167-0.499） in the high-risk group and 64.6% （95%CI=0.436-0.665） in the low-risk group， and the model could be used as an independent factor for predicting bladder cancer prognosis.

Conclusion[WTBZ] Autophagy genes are associated with prognostic survival in bladder cancer.

[KEY WORDS] urinary bladder neoplasms; autophagy related genes; proportional hazards models; the cancer genome atlas

膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一，也是我国老年人群中高致死率的癌症[1-2]。膀胱癌最常见的病理类型是尿路上皮癌，其具有耐药性强、转移率高、复发率高、预后差等特点[3-4]。虽然手术、放疗和辅助化疗的应用大大改善了膀胱癌病人的预后，但膀胱癌致死率仍居高不下[5]。因此，需要寻找新的方法来提高膀胱癌病人的诊断和预后。近年来，分子标志物已经被证实有助于膀胱癌的诊断和治疗[6]。已有研究表明，膀胱癌病人的晚期无进展生存与某些分子标志物高表达相关[7-8]。然而，由于研究缺乏更大的临床研究队列，这些潜在生物标志物的功能以及临床意义无法得到充分验证。自噬在细胞的代谢过程中具有平衡作用，正常情况下自噬可以清除功能受损的细胞器以及表达错误的蛋白质[9]。人类发展过程中的多种疾病与自噬相关，并且自噬与肿瘤的发生也存在密切关系[10]。自噬对于肿瘤是一把双刃剑，早期可以抑制肿瘤的形成，晚期可以促进肿瘤的生长和转移[11]。近年来有研究表明，自噬基因可以通过信号通路诱导膀胱癌浸润和转移[12-13]。因此，自噬基因可能作为膀胱癌诊断以及预后的分子标志物。本研究从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中获取膀胱癌转录组数据进行分析，并且构建自噬相关基因（DEARGs）的预后模型，评估该模型的预后预测能力。

1资料与方法

1.1数据来源

从TCGA数据库中获取了430例样本的转录组数据（HTSeq-FPKM），其中癌旁组织19例，膀胱癌组织411例。GSE31684数据集从基因表达综合数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE31684）中下载获得[14-15]。DEARGs来源于人类自噬数据库（HADb，http：//www.autophagy.lu/），从该数据库中获得了232个自噬基因，其中194个基因在TCGA数据库中表达。

1.2DEARGs差异表达分析

对瘤旁组织和膀胱癌组织的转录组数据进行分析，筛选差异表达的DEARGs。在R语言（版本3.6.2）环境下进行操作，首先使用“limma”包对数据进行校正归一化处理，筛选标准为|logFC|>1（实验组/对照组>2），错误发现率（FDR）<0.05。采用Wilcoxon检验进行差异分析，最后使用“pheatmap”和“ggpubr”包对DEARGs进行可视化处理。

1.3DEARGs在膀胱癌中的生物学功能分析

对DEARGs进行基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。在R语言环境下，使用“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”和“enrichplot”等软件包对数据进行可视化处理（P<0.05，Q<0.05，Q值为校正后的P值）。

1.4DEARGs预后风险模型的构建

首先，在R语言环境下使用“survival”软件包对DEARGs进行单因素Cox回归分析，筛选与预后生存相关的自噬基因，以P<0.05为差异有显著意义。随后，将以上筛选到的与生存相关的自噬基因进行多因素Cox回归分析。最后，构建自噬基因的风险预测模型，根据风险模型计算每一样本的风险评分，

以风险评分中位值为界将样本分为高风险组和低风险组，观察两组病人生存状态。风险评分=

expRNA1×βRNA1+expRNA2×βRNA2+…+expRNAn×βRNAn，其中exp是差異表达基因的表达量，RNA1～RNAn代表每一基因的名称，β是Cox回归模型的多元回归系数。

1.5预后风险模型的评估

在R语言环境下使用“survival”包对高低风险组的病人进行预后分析，利用Kaplan-Meier（K-M）检验方法和log-rank检验评估高低风险组病人的生存预后。使用“survival ROC”包绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估该模型的准确性。

1.6外部数据集对于模型的验证

使用GSE31684数据集验证风险模型的预测性能，根据模型风险评分的中位值将样本分为高风险组和低风险组，观察两组病人总体生存状态，绘制ROC曲线评估结果准确性。

1.7独立预后分析

将样本的风险评分和临床指标进行单因素和多因素Cox回归分析，综合评估风险评分与膀胱癌病人预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1DEARGs的筛选

根据筛选标准（|logFC|>1、FDR<0.05）获得DEARGs 37个，其中19个基因表达下调，18个基因表达上调（图1A）。依据|logFC|排序，表达上调的前

10个基因为：[STBX]CDKN2A、SERPINA1、BIRC5、

TP73、ATG9B、EIF4EBP1、SPHK1、ERBB2、BID和ITGA3;表达下调的前10个基因为：[STBX]FOS、CCL2、HSPB8、PRKN、ITPR1、TP53INP2、NRG2、MYC、DLC1和BCL2。

2.2DEARGs的生物学功能分析

GO富集分析的结果显示，生物过程（BP）主要包含内在凋亡信号通路、神经元死亡、内质网应激反应、自噬和自噬信号通路等，细胞组成（CC）主要包含自噬体、内质网腔体、外膜、线粒体外膜和细胞器外膜等，分子功能（MF）主要涉及泛素蛋白连接酶的结合、磷酸酶结合、死亡结构域结合、BH结构域结合及蛋白酶结合等。见图1B。KEGG分析的结果则显示，DEARGs主要与肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、细胞凋亡、凋亡-多物种、膀胱癌、慢性骨髓性白血病、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、内分泌的阻力、ErbB信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路和铂耐药等通路相关（图1C）。

2.3自噬风险模型的构建与评估

[CM（20]对37个DEARGs进行单因素Cox回归分析，结果发现共有7个基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC、SPHK1）与膀胱癌病人的预后显著相关（P<0.05）。将其纳入多因素Cox回归分析，最终得到了包含6个自噬基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC）的风险模型。热图分析结果显示，与低风险组比较，高风险组[STBX]DIRAS3、MYC、P4HB基因表达上调，[STBX]APOL1、ITGA3则表达下调，而[STBX]SPNS1的表达在两组中并无明显差异（图2A）。低风险组的总体生存优于高风险组（图2B、C）。根据风险模型计算了每例膀胱癌病人的风险评分，高风险组201例，低风险组202例。K-M分析结果显示，高风险组3年生存率为41.4%（95%CI=0.334～0.513），低风险组为57.7%（95%CI=0.490～0.679），高风险组的预后生存率低于低风险组（图3A）。ROC曲线分析结果显示，膀胱癌病人3年生存期的AUC为0.789（图3B）。

2.4外部数据集对于模型的验证

使用GEO数据集中的GSE31684数据集对模型的预测能力进行验证，根据风险模型的风险评分，将病人分为高风险组（46例）、低风险组（47例）。K-M生存分析结果显示，高风险组的预后差于低风险组，高风险组的3年生存率为31.6%（95%CI=0.3167～0.499），低风险组3年生存率为64.6%（95%CI=0.436～0.665）。ROC曲线分析结果显示，膀胱癌病人3年生存期的AUC为0.652（图3C、D）。

2.5独立预后验证

单因素Cox回归分析结果显示，病人肿瘤分期（HR=1.763，95%CI=1.236～2.515，P<0.01）、肿瘤浸润深度（HR=1.695，95%CI=1.152～2.495，P<0.01）、淋巴结转移（HR=1.531，95%CI=1.165～2.013，P<0.01）和模型风险评分（HR=1.828，95%CI=1.438～2.324，P<0.001）与膀胱癌病人预后相关。多因素Cox回归分析结果显示，风险评分（HR=1.933，95%CI=1.457～2.563，P<0.001）可以作为膀胱癌病人预后的独立影响因素。见图4。

火山图：图中每一点代表一个自噬基因，其中黑色点代表无差异表达基因，红色点代表表达上调基因，绿色点则代表表达下调基因。B为GO富集分析：图中形状的大小代表富集基因的数量，形状越大代表富集的基因越多;颜色代表P值的大小，P值越小颜色越红，反之越蓝（P<0.05）。C为KEGG通路富集分析：图中每行代表一个生物功能通路，其中方格代表富集于该通路的基因，颜色则代表基因表达差异的倍数，颜色越红代表表达差异倍数越大。

A：风险模型对于高风险组和低风险组的生存预后分析;B：ROC曲线对风险模型预测准确性的分析结果;C：风险模型对于GEO数据集中高低风险组的生存预后分析;D：风险模型对于GEO数据集分析结果准确性分析。

3讨论

一般情况下，体内的自噬水平一直处于相对平衡的生理状态，自噬在肿瘤的发生、形成和转移的过程中具有重要作用[16]。在肿瘤形成的初期，自噬可以抑制肿瘤的形成。但是在肿瘤形成后，自噬则会促进肿瘤生长和侵袭，此时的自噬就会成为肿瘤的促进因素[17]。目前，对膀胱癌自噬研究比较局限、单一。本文研究筛选膀胱癌癌旁组织和膀胱癌组织中DEARGs，并探讨其生物学功能。GO富集分析结果显示，DEARGs主要与BP（主要包含内在凋亡信号通路、神经元死亡、内质网应激反应、自噬和自噬信号通路）、CC（主要包含自噬体、内质网腔体、外膜、线粒体外膜和细胞器外膜）和MF（主要涉及泛素蛋白连接酶的结合、磷酸酶结合、死亡结构域结合、BH结构域结合及蛋白酶结合）相关;KEGG分析结果显示，DEARGs主要与ALS、细胞凋亡、凋亡-多物种、膀胱癌、慢性骨髓性白血病、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、内分泌的阻力、ErbB信号通路、P53信号通路、PI3K-Akt信号通路和铂耐药等通路相关，这说明膀胱癌DEARGs与癌症相关通路及肿瘤耐药相关。目前研究认为，PI3K-Akt信号通路和铂耐药通路相关，RrbB2可以诱导血管生长并促进膀胱癌的转移[18];在膀胱癌中，3-BrPA可以通过抑制P53通路从而有效抑制膀胱癌的发生和转移[19];PI3K-Akt信号通路可以调节上皮间质化和侵袭，在浸润性膀胱癌中已发现了类似的FGFR3突变[20];DEARGs还与铂类药物耐药相关，有些膀胱癌病人应用此类药物治疗效果不佳，可能与膀胱癌的耐药机制相关[7]。其机制是否与DEARGs相关，有待进一步研究。

本文研究构建了含有6个自噬基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC）的風险模型，其中[STBX]DIRAS3和ITGA3可以作为膀胱癌预后的生物标志物[7-8]，MYC可以通过各种机制促进膀胱癌的转移和浸润[21]。关于[STBX]SPNS1、APOL1和P4HB基因在膀胱癌中的作用尚不明确，需进一步的研究和探索。但已有研究显示，[STBX]SPNS1与P53信号通路相关[22]。[STBX]APOL1可以作为胰腺癌的肿瘤标志物[23]。在肾透明细胞癌中[STBX]P4HB可以作为预后不良的肿瘤标志物[24]。本研究建立的模型可以有效划分高、低风险的病人，预测结果也准确有效，并且该结果在外部数据集中也得到了验证。该模型的风险评分也可作为预测膀胱癌病人预后的独立因素。因此，本文构建的自噬基因相关模型可以筛查高风险的膀胱癌病人，提前干预、治疗从而改善病人的预后。

綜上所述，本文筛选并构建了含有以下6个基因[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3和MYC的风险模型，该模型可以很好地筛选高风险的膀胱癌病人，其风险评分还可以作为预测膀胱癌病人预后的一个独立因素。本研究结果为后期膀胱癌的早期诊断及前期干预治疗，改善病人预后提供了可靠的理论基础依据。

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（本文編辑黄建乡）