双孢菇菇柄酵素发酵条件优化及其抗氧化活性分析

邵洋洋，郜海燕，刘瑞玲，李 斌，陈杭君,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品采后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江杭州 310021）

双孢菇（Agaricus bisporus）又称口蘑、白蘑菇、洋蘑菇[1]，是全球生产和消费量最高的食用菌[2]，也是我国生产量最多的食用菌之一[3]。双孢菇味道鲜美，营养丰富[4]，具有消炎解毒、降低胆固醇、预防动脉硬化等药用价值[5]。但是，在采收与加工过程中，大量双孢菇菇柄被切除并丢弃，造成了资源浪费和环境污染[6]。研究发现，双孢菇菇柄和菌盖均含有蛋白质、氨基酸、多糖、核酸、核苷酸等成分[7]，因而可以对废弃的菇柄加以综合利用，进一步提高其利用价值。

酵素主要是以果蔬为原料，经过微生物如酵母、乳酸菌等发酵，是一种富含矿物质、维生素、酶等特定生物活性成分的产品[8]，其能够有效促进新陈代谢，具有预防衰老、抗菌抗癌、解毒消炎等功能。在发酵过程中，益生菌可以将果蔬中的营养成分如蛋白质、维生素、糖类等通过代谢转换成氨基酸、酶类、有机酸等小分子活性物质，从而增强果蔬自身的营养密度并提高其利用度[9]。刘维兵等[10]以葡萄与海棠果为原材料，利用酵母菌进行发酵，发现发酵后的酵素有一定的抑菌性和抗氧化活性。郭伟峰等[11]研究发现桑葚酵素饮料的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）酶活力显著高于桑葚果汁的SOD酶活力。蒋增良等[12]的研究指出，葡萄酵素的还原能力水平、DPPH、超氧阴离子、羟自由基以及ABTS自由基清除能力和酵素浓度之间呈正相关性。

目前，双孢菇主要通过烹饪或以干制的方式被人们食用，菇柄利用以饲料为主，具有很大的局限性。将双孢菇菇柄进行发酵制成酵素，不仅能够保持双孢菇自身的营养功能成分还能提高原料的利用率，降低生产成本，此外发酵生产可以拓宽双孢菇食用的局限性，提高其附加值[13]。近年来，酵素产品层出不穷且越来越受到大众欢迎，但双孢菇酵素的工艺优化及抗氧化能力研究鲜有报道。本文以双孢菇加工中的菇柄为原料，采用植物乳杆菌进行发酵，研制出一种具有高生物活性的发酵产物，并评估其抗氧化能力，继而为双孢菇副产物的利用提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢菇菇柄 浙江嘉善宁远农业有限责任公司；植物乳杆菌（编号336421） 广州生物菌种保存中心；福林酚、铁氰化钾、氢氧化钠、磷酸、邻菲罗啉、没食子酸、3.5-二硝基水杨酸、愈创木酚 上海凌峰化学试剂有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；所有试剂均为分析纯。

Awanti J-E 高速离心机 贝克曼库尔特（美国）股份有限公司；MLS-3781L-PC 型高压蒸汽灭菌器 松下健康医疗器械株式会社；SPX-250B-G 微电脑光照培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；无菌超净工作台 江苏苏净集团有限公司；MIR-253 低温培养箱 日本SANYO 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双孢菇菇柄酵素制备 将新鲜菇柄洗净，在100 ℃下漂烫2 min，晾干，通过预实验确定最佳料液比为1:6（W/V），按照此比例进行打浆，得到菇柄原液。根据实验设定加入不同比例的蔗糖与植物乳杆菌在37 ℃条件下发酵，待发酵结束后，将发酵液过滤得到菇柄酵素，将其置于4 ℃与25 ℃进行贮藏，测定抗氧化活性。

1.2.2 菌种活化 准备培养菌种所需的液体培养基（10 g 蛋白胨，10 g 牛肉膏，4 g 酵母粉，20 g 葡萄糖，0.2 g 硫酸镁，5 g 乙酸钠，2 g 柠檬酸三铵，2 g 磷酸氢二钾，0.04 g 硫酸锰，1 g 吐温80）和2 个平板。无菌条件下吸取0.5 mL 液体培养基溶液打入菌种冻干管内，混合均匀后再次转移到液体培养基中，再吸取0.2 mL 菌悬液进行涂布，将涂布完成后的2 个平板连同液体培养基一起放入37 ℃培养箱中，培养24 h，得到活菌数为105~106CFU/mL 的植物乳杆菌悬液。

1.2.3 酵素制备单因素实验

1.2.3.1 植物乳杆菌接种量 菇柄原液30 mL，糖添加量10%（W/V），分别添加植物乳杆菌1%、2%、3%、4%、5%（V/V）的接种量，于37 ℃培养箱中进行发酵，样品发酵24 h 后即结束发酵，然后对其进行感官评定并测定总酚含量，考察接种量对感官评分与总酚含量的影响。

1.2.3.2 糖添加量 菇柄原液30 mL，植物乳杆菌接种量为3%，分别加入原液体积的0、5%、10%、15%、20%（W/V）的蔗糖，于37 ℃培养箱中进行发酵，样品在发酵24 h 后即结束发酵，然后对其进行感官评定并测定总酚含量，考察糖添加量对感官评分与总酚含量的影响。

1.2.3.3 发酵时间 菇柄原液30 mL，植物乳杆菌接种量3%，加入10%的蔗糖，于37 ℃培养箱中发酵0、12、24、36、48 h，发酵结束后进行感官评价与总酚含量测定，考察发酵时间对感官评分与总酚含量的影响。

以《桂林山水》这篇课文为例，教师可以先提出问题，然后采用小组讨论的方法让学生思考，之后再由每个小组成员依次汇报总结。这样可以将全员都融合到课堂中来，也利于提升学生的语言表达能力。之后，教师可以采用情境代入法，利用大屏幕或投影仪等多媒体，给学生播放桂林山水的图片或视频，让学生直观地领略到桂林山水的景色，增加感情体验。最后，教师可以组织讨论环节，讨论大家知道的祖国景观或人文景点等，再通过感情渲染激发出学生的民族自豪感和爱国主义情怀。

1.2.4 响应面试验 根据单因素实验结果，选择接种量、糖添加量、发酵时间进行试验优化，应用Box-Behnken 试验设计原理[14]，以总酚含量为双孢菇菇柄酵素发酵的响应值，进行响应面分析。采用Design Expert 12 软件处理数据与回归分析，从而确定出最优的酵素发酵工艺条件。Box-Behnken 试验因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素水平及编码Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experiment

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 感官评价 采用百分制评分检验法[15]，选择5 位男性和5 位女性，年龄在20~30 岁之间的有经验品评者对加工后成品的色泽、滋味、香气、组织状态进行评分，取均值作为感官评价得分。感官评价表[13]见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation form

1.2.5.2 总酚含量 参照Folin-Ciocaulten 方法测定[16]。取1 mL 样品液于15 mL 的试管中，分别加入1 mL福林酚试剂与3 mL 20% Na2CO3，混匀，在50 ℃水浴反应30 min。在765 nm 下测定吸光度。

1.2.5.3 抗坏血酸含量测定 参照吴媛媛等[17]的方法测定。取0.2 g 样品加入2 mL 50 g/L 的TCA，12000×g 离心10 min，取1 mL 上清液，加入1 mL 的50 g/L 的TCA，然后加入无水乙醇1.0 mL，混合摇匀后，再加入0.4%磷酸-乙醇溶液，0.5% BP-乙醇溶液，1 mL 0.3 g/L FeCl3-乙醇溶液，在534 nm 处测定吸光度。

1.2.5.4 DPPH 自由基清除率的测定 参考Wang等[18]的方法并加以修改，取1 mL 稀释5 倍的双孢菇菇柄酵素样品稀释液，加入1 mL 1 mmol/L 的DPPH 混合均匀，暗处静置30 min，记录517 nm 处反应液吸光度值A1；取1 mL 蒸馏水，1 mL 1 mmol/L 的DPPH 混合均匀，避光静置30 min，记录反应液吸光度值A0；取1 mL 稀释样品，加入1 mL 1 mmol/L 的无水乙醇，混合均匀，避光静置30 min，记录反应液吸光度值A2。计算公式为：

1.2.5.5 ABTS 自由基清除率的测定 采用Zhang等[19]的方法。将5 mL 7.4 mmol/L ABTS 储备溶液与88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8混合并静置12~16 h制备ABTS 工作溶液。用PBS 溶液将ABTS 的工作稀释，使其在734 nm 处的吸光度值为0.7±0.02。吸取100 μL 稀释5 倍的试样上清液与0.5 mL ABTS工作液混匀，样品于室温下避光静置6 min。在734 nm 处测定吸光度值。

1.2.5.6 还原力测定 参考Liu 等[20]的方法，取0.5 mL稀释样品液于10 mL 离心管内，然后在试管中加入2.5 mL 0.1 g/mL 铁氰化钾混匀，在50 ℃下反应30 min 后，继续加入2.5 mL 0.1 g/mL 三氯乙酸，混匀后在8000 r/min 条件下离心10 min。取1 mL 离心后的上清液，依次加入1 mL 蒸馏水与0.5 mL 1 g/L三氯化铁，混匀。以蒸馏水作为对照，在593 nm 下测定吸光度值。

1.2.5.7 总抗氧化能力测定 参考总抗氧化能力（TAOC）测定，按照试剂盒说明书以及试剂盒中所带试剂进行测定，单位U/mL。

1.3 数据处理

每个试验均基于3 个重复，采用Design-Expert 12 和Graphpad Prism 8.0.2 软件进行数据处理、统计分析和图表绘制，用SPSS 23.0 对实验数据进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 双孢菇菇柄酵素发酵单因素实验

2.1.1 植物乳杆菌接种量对双孢菇菇柄酵素发酵品质的影响 如图1 所示，接种量在1%~5%之间时，感官评分与总酚含量随着接种量的增加呈现先上升后下降的趋势，接种量为3%时，感官评分与总酚含量达到最高，分别为84.20 分和1.77 mg/mL；接种量超过3%后，随接种量的增加，感官评分与总酚含量都逐渐下降，下降的原因可能是由于植物乳杆菌接种量不断增加，导致在相同的时间内糖被完全消耗[21]，双孢菇菇柄酵素口感较酸。同时菌体因正常新陈代谢消耗的养分过多，而导致发酵产物减少[22]，总酚含量降低，接种量对酵素的感官品质与总酚含量有显著影响（P＜0.05），故选择3%的接种量为最佳接种量。

图1 植物乳杆菌接种量对菇柄酵素发酵品质的影响Fig.1 Effect ofLactobacillus plantaruminoculation amount on fermentation quality of stipe enzyme注：不同字母代表同一指标不同条件间差异显著（P＜0.05）；图2~图3 同。

2.1.2 糖添加量对双孢菇菇柄酵素发酵品质的影响

由图2 可知，在相同的发酵条件下增加糖添加量，感官评分与总酚含量呈先上升后下降的趋势，当糖添加量为10%时，感官评分值最高为84.10 分，总酚含量也达到最高值为1.78 mg/mL。糖添加量较小时，酵素的蘑菇气味较重，口感发涩，感官评分较低。当植物乳杆菌接种量为3%，糖添加量超过10%，糖不能够完全被植物乳杆菌消耗利用，导致酵素偏甜，口感甜腻。糖添加量增加，使pH 升高，从而抑制植物乳杆菌生长，活菌数减少[23]，总酚含量下降。因此结合两个指标，确定最适糖添加量为10%。

图2 糖添加量对菇柄酵素发酵品质的影响Fig.2 Effect of the amount of sugar on fermentation quality of stipe enzyme

2.1.3 发酵时间对双孢菇菇柄酵素发酵品质的影响

由图3 可以看出，随发酵时间的增加，感官评分和总酚含量开始上升。发酵初期时，酵素具有发酵的乳酸香味但蘑菇气味浓重，口感粗糙，感官评分较低。发酵12 h 后总酚含量最低。当发酵时间达到24 h 时，感官评分最高达到84.70 分，总酚含量达最高值1.77 mg/mL，当发酵时间继续延长，感官评分和总酚含量值均呈现出下降趋势。这可能是由于延长发酵时间，24 h 后植物乳杆菌的密度增加且活性下降，转而消耗营养产物，加快酵素中总酚的氧化分解，致使在24 h 后总酚浓度降低[23]，同时随着发酵时间的增加，酵素的酸味浓重且有异味，致使感官评分下降。因此确定发酵时间24 h 为最适发酵时间。

图3 发酵时间对菇柄酵素对发酵品质的影响Fig.3 Effect of fermentation time on fermentation quality of stipe enzyme

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 基于单因素实验结果，对双孢菇酵素发酵工艺进行优化。结果见表3。利用Design Expert 12 软件，对表3 的数据建立二次多元回归方程为：Y=2.19−0.0252A−0.015B+0.0127 C−0.0392AB+0.2777AC+0.1655BC−0.2858A2−0.084 B2−0.4577C2。

表3 Box-Behnken 试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

由表4 可知，试验模型的F=25.29，P＜0.01，表示该回归模型极显著。回归系数R2=0.9702>0.9，失拟项不显著（P=0.0794>0.05），说明响应值的97.02%的变化来自所选变量，拟合度高，实验误差小，表明回归模型与检验结果的拟合程度越高，自变量与响应值的关系显著[24]。因此，可以利用该模型预测上述发酵条件对酵素中总酚含量的影响。但并不是意味着R2越大模型的一致性越好，对于一个好的统计模型，模型调整确定系数（=0.9318）应该与R2相似，以更好地说明模型的有效性[25−26]。各项P值小于0.05 时所对应的工艺条件对产品总酚含量是有显著影响的，由表4 可知，一次项A、B、C 均不显著（P>0.05）；交互项AB（P=0.4053>0.05）不显著，而BC（P=0.0073＜0.01）、AC（P=0.0004＜0.01）极显著。F值反映了各因素对于响应值的重要性，A>B>C，对产品综合得分的影响大小顺序为：接种量>糖添加量>发酵时间。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analyses of variance of regression equation

微生物发酵可以改变酵素中总酚含量及酚的种类组成[27]，许多研究表明酚类化合物具有很强的自由基清除能力[28−29]，所以酚类物质是酵素行业广泛测定的抗氧化指标之一。响应面和等高线图都可以直接反应各种试验因素间的交互作用，等高线图也可以反应交互影响的大小，图越趋向椭圆说明交互作用就越强[30]。从图4A 可知，接种量（A）和糖添加量（B）的等高线图趋于圆形，且响应面图曲面较平，交互作用不明显，在接种量不变的条件下，总酚含量随糖添加量的增加而呈先升高后下降的趋势，在9%~11%，总酚含量较高，接种量也同单因素实验的结果相符。由图4B 可知，接种量（A）与发酵时间（C）的等高线图接近于椭圆型，响应面图曲面陡峭，交互作用显著，在接种量不变的条件下，总酚含量随糖添加量的增加而先升高后下降，总酚含量在接种量2.5%~3.5%、发酵时间在18~24 h 范围内有最大值。如图4C 所示，糖添加量（B）与发酵时间（C）的等高线图趋于椭圆，响应面图曲面陡峭，交互作用明显，在糖添加量不变的条件下，总酚含量随发酵时间的增加呈先升高后下降的趋势，发酵时间在18~24 h，总酚含量较高。

图4 各因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface diagram and contour diagram of interaction of various factors

2.3 验证性试验结果

根据响应面试验结果分析计算得到双孢菇菇柄酵素发酵的最优条件为：植物乳杆菌接种量2.95%，糖添加量9.53%，发酵时间23.79 h。根据实际生产操作，将发酵条件修改为植物乳杆菌接种量3%，糖添加量9.50%，发酵时间24 h，进行3 次重复验证试验，所得总酚含量为（2.20±0.01）mg/mL，与预测值2.19 mg/mL 无明显差异。以上结果证实了该模型能够充分可靠地优化双孢菇菇柄酵素发酵工艺。

2.4 双孢菇菇柄发酵前后抗氧化活性的变化

多酚类化合物是蘑菇中主要抗氧化成份之一，它可以防治癌症、减少心脑血管病变，在保护健康，抗老化等方面也有着一定的生物学活性[31]，通过益生菌的发酵，双孢菇菇柄中的多酚类物质被转化利用，含量均呈上升趋势，在表5 中，双孢菇菇柄酵素发酵后总酚含量为2.20 mg/mL，比发酵前的菇柄原液总酚含量增加了29.41%；抗坏血酸含量为44.40 μg/mL，是发酵前的1.56 倍。除此以外，DPPH、ABTS 自由基清除率等抗氧化能力也显著增加（P＜0.05），这与王虹玲等[32]的研究结果一致。

表5 样品发酵前后指标对比Table 5 Comparison of the indexes of samples before and after fermentation

2.5 双孢菇菇柄酵素贮藏期间抗氧化活性的变化

为分析双孢菇酵素产品在贮藏期间的抗氧化能力变化，以及最适贮藏温度，将发酵完成的双孢菇菇柄酵素分别置于4 ℃与25 ℃条件下进行贮藏，并测定其贮藏期间DPPH、ABTS 自由基清除率以及铁离子还原力的变化趋势。如图5A 所示，随着贮藏时间的增加，酵素的DPPH 自由基清除率呈现下降趋势，对两组贮藏温度进行比较，25 ℃贮藏的酵素自由基清除率显著低于4 ℃贮藏（P＜0.05）。贮藏至4 d 时，4 ℃贮藏的双孢菇菇柄酵素的DPPH 自由基清除率是25 ℃贮藏的1.11 倍。在贮藏过程中，ABTS可被活性氧氧化产生稳定的绿色ABTS+·，当ABTS+自由基生成过多或消除速度过慢时，会对生物体组织造成严重破坏，从而促进机体的老化并引起各类病症，抗氧化物的存在能够抑制自由基的产生[33]。如图5B 所示，双孢菇酵素的ABTS 自由基清除率均呈下降趋势，与DPPH 相同，25 ℃贮藏的酵素自由基清除率显著低于4 ℃贮藏（P＜0.05）。贮藏至5 d，25 ℃的双孢菇酵素ABTS 自由基清除率低于35%。这可能是因为贮藏时间延长，温度升高，微生物活性降低，使其抗氧化活性降低。李杰等[34]通过对核桃青皮果蔬酵素体外抗氧化活性研究发现，随着酵素浓度增加，微生物活性增加，其抗氧化能力增加，与本实验结果相似。由图5C 可知，两组温度下贮藏样品的还原力均呈下降趋势，贮藏2 d 后，样品的还原力下降趋势变小，两组贮藏温度下的双孢菇菇柄酵素还原力没有显著差异（P>0.05）。通过对图5D分析可知，两组温度下贮藏的样品总抗氧化能力均呈下降趋势，与还原力相同，贮藏2 d 后，样品总抗氧化能力变化较小，差异不显著（P>0.05）。

图5 双孢菇菇柄酵素在4 ℃与25 ℃贮藏的抗氧化能力变化Fig.5 Changes of antioxidant capacity ofAgaricus bisporusstipe enzymes stored at 4 ℃ and 25 ℃注：不同小写字母表示同一时间不同贮藏温度间差异显著（P＜0.05）。

3 结论

双孢菇菇柄酵素在37 ℃下的最优发酵条件：植物乳杆菌接种量3%、糖添加量9.50%，发酵时间24 h。经本试验优化得到的菇柄酵素口感酸甜适宜，澄清透明，在此条件下得到的酵素总酚含量达到2.20 mg/mL，比未发酵样品提升了29.41%；抗坏血酸含量为44.40 μg/mL，提升了1.56 倍。同时，对发酵后菇柄酵素的抗氧化性进行研究发现，发酵后的DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率以及总抗氧化能力显著高于发酵前（P＜0.05），表明通过现代微生物发酵技术，可以制备出具有良好抗氧化活性的酵素产品。将该酵素分别置于4 ℃与25 ℃下进行贮藏，进一步研究表明，其在贮藏期间的DPPH、ABTS 自由基清除率呈现明显下降趋势。在贮藏初期，铁离子还原力与总抗氧化能力下降较快，且酵素的总抗氧化能力随着贮藏温度的升高及时间的延长而呈现不同程度的降低。双孢菇菇柄酵素的研究开发，有效实现了废物利用并减少资源浪费，也为工业化生产提供了理论依据。