微生物在不同pH下对水稻土胶体中砷释放的影响

陈爽，张翅鹏，黄臣臣，张凯璇，杨泽延，罗江兰

（1.贵州大学资源与环境工程学院，贵阳550025；2.喀斯特地质资源与环境教育部重点实验室，贵阳550025；3.贵州喀斯特环境生态系统教育部野外科学观测研究站，贵阳550025）

类金属砷（As）广泛存在于土壤、水、岩石中，我国土壤中As平均含量为10 mg·kg。但矿物不合理开采、农药使用、金属冶炼等人为活动，导致As 释放到周围环境中，As 进入农田后，不仅影响水稻安全生产，还可通过食物链对人类健康造成严重的危害。土壤胶体具有带电性、比表面积大、吸附能力强等特点，对土壤中As 的迁移转化有着重要作用，其性质随土壤环境条件的变化而发生改变，从而也会影响到As的生物环境地球化学行为。

本研究在前人研究微生物异化还原铁氧化物的基础上，通过提取土壤菌悬液在不同pH 条件下作用于载As土壤胶体，开展厌氧培养实验，着重分析了微生物在含As 土壤胶体释放As 过程中的作用，同时讨论了培养过程中pH 变化对微生物的影响，进而探讨其对胶体Fe 还原及As 释放过程的作用，以揭示在微生物驱动下土壤胶体中As 还原释放的地球化学特征，为土壤As污染防治提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 载As土壤胶体的制备

供试土壤采自贵州省黔西南州兴仁市交乐村石头寨水库下游水稻田。选择水库下游河流周边3 个农田土壤理化性质基本一致的水稻土进行采样，使用便携式不扰动土壤采样器采集0～20 cm 表层土，均匀混合后利用沉淀虹吸分离法提取土壤胶体，反复提取土壤悬液中胶体颗粒，直至溶液上层澄清。提取完毕后离心浓缩，冷冻干燥后保存备用，其基本理化性质如表1所示。

表1 土壤胶体基本性质Table 1 Basic characteristics of soil colloid

称取25 g 土壤胶体，加入500 mL 1 000 mg·L的As（Ⅴ）溶液，放置于温度为25 ℃、振荡条件为180 r·min的恒温振荡器中振荡24 h，随后以6 000 r·min的转速离心10 min，再用超纯水洗涤5 次后冷冻干燥，研磨过200目筛后保存备用。

1.1.2 土壤微生物分布及菌悬液的提取

将混合均匀的新鲜土壤样品送至上海生工生物科技有限公司进行微生物种群的测定，经PCR 扩增后借助Illumina MiSeq 高通量测序技术分析。如表2所示，丰度较高的菌属包括酸杆菌门（、、、、、、）、、厌氧黏细菌（）、芽单胞菌属（）、鞘氨醇单胞菌属（），其分别占比为23.53%、2.63%、3.23%、3.14%、3.16%。水稻土中含有丰富的铁还原菌，共检测出11种，占微生物总数的4.90%。其中丰度较高的菌属是地杆菌（，1.35%）和厌氧黏细菌（3.23%）。有研究表明地杆菌和厌氧黏细菌及酸杆菌均具有异化还原铁的能力。称取10 g 新鲜土壤放置于250 mL 三角烧瓶中，加入0.10%焦磷酸钠溶液，在180 r·min的恒温振荡器中振荡30 min后静置30 min，上清液为土壤菌悬液。

表2 水稻土微生物菌属的分布（%）Table 2 Distribution of paddy soil microbial genera（%）

1.1.3 基础培养基的配制

基础盐培养基（Minimal salt medium，MSM）的配制：KHPO0.14 g·L，NHCl 0.25 g·L，KCl 0.5 g·L，NaCl 1.0 g·L，CaCl·2HO 0.13 g·L，MgCl·HO 0.62 g·L，（NH）SO0.5 g·L，乙酸钠2 mol·L。用1 mol·L的NaOH 调节pH为7，配制完成后放置在温度为121 ℃、压力为0.105 MPa 的高温灭菌锅中灭菌20 min。

1.2 培养实验

称取载As（V）水稻土胶体0.20 g 于50 mL 具塞厌氧瓶中，用高压灭菌锅在温度为121 ℃、压力为0.105 MPa下灭菌21 min。空白处理组（KB）：加入25 mL 2×MSM+25 mL 灭菌去离子水；菌悬液处理（JX）：加入25 mL 2×MSM+土壤菌悬液25 mL。采样地区水稻土pH 范围为3～7，因此分别调节初始pH 为3（KB-3、JX-3）和7（KB-7、JX-7）。置于30 ℃恒温培养箱中避光培养，在第1、3、7、14、21、28 天利用WTW（Multi 3430）水质参数仪测定系统中的pH 和Eh。以上操作均在厌氧操作箱中进行。

1.3 化学分析

Fe含量按照FREDRICKSON 等的盐酸酸洗法测定：取5 mL摇匀后的水土混合液，加入5 mL 1 mol·L的HCl，密闭，在30 ℃、170 r·min摇床中溶解1 h后离心分离，取上清液，加入邻菲啰啉和缓冲液显色10 min，用紫外分光光度计测定，检测波长为510 nm。

液相中总As 含量采用《水质 汞、砷、硒、铋和锑的测定 原子荧光法》（HJ 694—2014）中的方法测定，使用氢化物原子荧光光谱仪（AFS-9700）测定，先用国家As 标准物质配制1 000 mg·L的As 标准溶液，通过稀释得到不同含量As 的标准溶液，以含量为横坐标，荧光峰高为纵坐标，绘制标准曲线。As（Ⅲ）采取许珺辉等的方法测定，土壤胶体悬液用0.22µm滤膜过滤，使用高效液相色谱原子荧光联用仪（北京科创海光仪器有限公司，HPLC-AFS 9700）测定液相中As（Ⅲ）的含量，流动相为磷酸盐缓冲溶液（称取磷酸氢二钠1.790 8 g和磷酸二氢钾6.052 g，置于容量瓶中用超纯水稀释至1 L，用0.22µm 滤膜进行抽滤，超声15 min 脱气后使用）；载气流量400 mL·min；屏蔽气流量600 mL·min；蠕动泵速80 mL·min。As（Ⅴ）含量由液相中总As含量减去As（Ⅲ）含量得到。

1.4 数据处理

为得到As 释放最大速率及其所需时间，采用描述微生物生长动力学的Logistic 方程对不同处理As累积含量和时间的关系进行拟合。Logistic方程为：

式中：为不同时刻As 的含量，mg·L；为反应时间，d；为As 释放的最大潜势，mg·L；为反应速率常数；为模型参数。0.25为As 最大释放速率（），mg·L·d；ln/为最大释放速率对应的时间（T），d。

使用SPSS 21.0 对总As 和Fe（Ⅱ）含量变化分别与培养时间和有无细菌进行双因素方差分析。利用Microsoft Excel 2010和Origin 2018等软件进行数据处理分析及图表制作。

2 结果与分析

2.1 含As水稻土胶体悬液pH和Eh的变化

KB 与JX 处理的胶体悬液pH 随厌氧培养时间增加均呈上升的趋势（图1），至第28天，初始pH=3体系pH 分别增加0.22、0.18，初始pH=7 体系分别增加0.67、1.12。对比两体系KB 与JX 处理组pH 变化发现，JX-3 处理组pH 低于KB-3，而JX-7 处理组pH 高于KB-7，至培养结束时较KB-7处理组高0.45。各处理组Eh 随实验进行呈下降现象。KB-3 与JX-3 处理胶体悬液初始Eh 分别为239 mV 和240 mV，培养至28 d 时分别下降了10、9 mV，总体上Eh 变化较小；KB-7 与JX-7 处理胶体悬液初始Eh 分别为1 mV 和5 mV，3 d 后均为负值，呈还原状态，直至28 d 时分别降低了30 mV和60 mV（图1）。Nernst方程体系中pH每增加1 个单位，氧化还原电位降低59 mV，因此初始pH 越低、Eh 越高，越不利于形成还原环境。总之，与无菌组相比，在中性条件下微生物活动有助于土壤胶体悬液中pH 升高、Eh 降低，这会对胶体中Fe 和As 的生物地球化学循环有潜在影响。

图1 不同初始pH条件下胶体悬液中pH与Eh的变化Figure 1 Changes of pH and Eh in colloidal suspension under different initial pH conditions

2.2 水稻土胶体中铁氧化物的还原

微生物活动是影响土壤矿物转化的主要因素之一，铁氧化物作为电子受体，可被还原溶解，产生菱铁矿、蓝铁矿、磁铁矿和绿锈等各种含Fe的矿物。在不同初始pH 条件下，KB 与JX 处理的Fe含量均随厌氧培养时间的增加呈逐渐增大趋势（图2），不同体系下Fe含量的离散程度均较高，尤其是JX-7处理。在微生物作用下，JX-3处理组土壤胶体悬液中Fe含量高于KB-3 处理，第28 天时高出1.68 mg·L，约为KB-3的1.13倍；同时JX-7处理组微生物作用更加明显，第28 天时比KB-7 处理组高出13.59 mg·L，是其2.80 倍。双因素方差分析主体间效应检验结果也显示，不同初始pH 下KB 与JX 处理Fe 还原均呈现显著差异（＜0.05）；时间的变化对强酸条件下Fe 还原有显著影响（＜0.01），但对中性条件下Fe 还原无显著影响（表3），表明微生物的作用有利于Fe还原。厌氧培养前3 d，JX-7 处理组Fe增加量与JX-3 处理组相比较低，培养至第7 天时，JX-7 处理组Fe含量为15.45 mg·L，比JX-3 处理组高8.34 mg·L，在第21～28 d，pH=7 体系中Fe还原量出现减缓现象（图2）。分析认为在较低pH 条件下，铁氧化物还原转化过程中物理化学转化起主要作用，而在较高pH 条件下生物转化作用显著。因此，在厌氧环境中，微生物作用有助于土壤胶体中铁氧化物的还原转化，在近中性条件下作用更加明显。

图2 不同初始pH条件下胶体悬液中Fe2+含量变化Figure 2 Change of Fe2+content in colloidal suspension under different initial pH conditions

表3 时间变化与有无细菌处理对铁还原影响的双因素方差分析Table 3 A two-factor ANOVA of time variation and presence or absence of bacterial treatments on iron reduction

2.3 水稻土胶体中As的释放

不同初始pH 条件下含As 胶体悬液中As 含量变化趋势如图3 所示。初始pH=3 时，厌氧培养1 d 后，KB、JX 处理组总As含量急剧增加，由原始溶液0 mg·L分别增至2.26、2.62 mg·L，之后随培养时间的增加，总As 含量变化趋于平缓，直至第28 天时出现下降现象。初始pH=7 时，KB、JX 处理组总As 含量随厌氧培养时间推移呈现逐渐增大的趋势，至第28 天，KB-7 与JX-7 处理组总As 释放量分别是初始pH=3的1.5、1.6 倍。表明在强酸环境中水溶态As 可在短时间内被迅速淋溶释放，而在中性环境中，随着培养时间的增加，悬液的pH 升高和Eh 降低有利于Fe还原，进而促进As 的释放。双因素方差分析结果显示，两个体系中不仅KB 与JX 处理组总As 含量均呈现显著差异（＜0.05），而且在初始pH=7体系中，不同时间的总As 含量也呈现显著差异（=0.02）（表4）。对悬液中总As累积含量随培养时间变化进行Logistic拟合，两处理组间差异达到显著水平（＜0.05）；初始pH=3处理体系中，第0天时As释放速率达到最大，尤其是JX-3 组As 的达到0.26 mg·L·d，随着初始pH 的提高，As 达到的培养时间延长至第2 天，值与JX-3 相比也有所降低（表5）。拟合结果中不同处理的值在2.78～5.30 mg·L之间，占厌氧培养过程中As最大释放量的95.5%～102.5%。可见不同方式处理均能使胶体中As 释放，但胶体悬液中As 释放速率及其所需要的时间有所差异。因此，含As 水稻土中As的迁移与pH变化和微生物活动密切相关。

表4 时间变化与有无细菌处理对As释放影响的双因素方差分析Table 4 A two-factor ANOVA of time variation and presence or absence of bacterial treatment on arsenic release

表5 不同初始pH条件下胶体悬液中总As释放Logistic拟合结果（n=6）Table 5 Logistic fitting results of total As release in colloidal suspension under different initial pH conditions（n=6）

在厌氧培养过程中，As 以三价和五价两种形态在液相中存在（图3）。初始pH=3 时前期为As（Ⅴ），随实验进行有As（Ⅲ）出现，但含量较低，KB-3和JX-3 处理组中As（Ⅲ）含量均低于0.50 mg·L，至第28天，As（Ⅲ）分别约占总As释放量的11.63%和9.43%；初始pH=7 时，KB-7 和JX-7 处理组中As（Ⅲ）含量明显增大，在实验过程中其含量分别介于0.21～3.54、1.18～4.09 mg·L之间，其中JX 处理组在培养过程中As（Ⅲ）释放量均大于KB组，培养至第28天时As（Ⅲ）浓度相对KB 组增加0.55 mg·L。总之，在酸性条件下As 主要以As（Ⅴ）存在于胶体悬液中，而在中性条件下释放的As（Ⅴ）大部分被还原为As（Ⅲ）。

图3 不同初始pH条件下胶体悬液中As含量变化Figure 3 Changes in the concentration of arsenic species in colloidal suspension under different initial pH conditions

3 讨论

3.1 水稻土胶体悬液pH、Eh的变化

厌氧培养实验过程中，还原环境下的铁矿物与有机质氧化分解产生的还原性物质强烈作用，将会消耗H，使不同初始pH 处理土壤胶体悬液的pH 均上升。反应式为：

在初始pH=3 体系中，后期有菌组pH 低于无菌组，而在中性条件下异化还原铁氧化物过程中会消耗更多的质子，pH 上升幅度较大，因此，中性胶体悬液更适合微生物的生长。两个体系Eh变化也证实了这一观点。在强酸性条件下，微生物群落活动相对较弱，JX 处理胶体悬液Eh 变化与KB 处理差异较小，而在中性条件下微生物活性较强，呼吸作用使Eh 明显降低。所以，水稻土胶体悬液中pH 与Eh的变化主要是由微生物活动引起的。

3.2 pH变化对胶体中Fe还原的影响

有机质分解及微生物活动使水稻土胶体悬液pH发生变化，这将会影响Fe 的还原溶解。本研究中水稻土胶体含有丰富的Fe，含量高达37.90 g·kg（表1），低pH 有利于溶解胶体中的铁氧化物并释放Fe，而O/HO 的氧化还原电位（820 mV）和Fe/Fe（770 mV）相接近，这有利于微生物利用溶解释放的Fe进行呼吸获能，从而发生异化还原。因此，初始pH=3体系培养前期Fe 还原能力较强。同时不同初始pH体系中Fe 异化还原能力也可间接反映悬液中微生物群落及活性的变化。本研究供试水稻土含有丰富的铁还原菌，其中地杆菌、厌氧黏细菌分别占比为1.35%、3.23%。这两类细菌在pH 介于4～9 之间均可发生Fe 的异化还原，pH 为7 时还原量达到最大，但过低的pH 会抑制这两类细菌的生长。也有研究表明铁还原菌在中性环境中的数量远高于酸性条件下。因此，结合本文JX-7 与JX-3 处理组Fe浓度变化，推测认为在中性溶液中铁还原菌对Fe 异化还原起主导作用，低pH 条件下，微生物还原Fe 的能力受到抑制，不利于Fe 的异化还原。但JX-7 处理后期Fe 还原速率趋于平缓，这是由于细菌细胞表面在中性环境中一般带负电荷，随着初始pH=7 体系中Fe含量增多，Fe可在细菌与铁矿物表面发生静电吸附，减少电子穿梭体与铁氧化物和微生物的接触位点，不利于异化反应的进行，从而减弱Fe 的还原转化。

3.3 胶体中As的释放与pH及Fe还原的关系

铁氧化物的还原溶解及pH的改变对胶体中负载As 的释放有着显著影响。相关性分析显示，在两种初始pH 条件下pH 的变化均与Fe浓度呈显著正相关（表6），表明体系pH 的变化与铁氧化物的还原转化有着密切关系。同时还原产生的Fe量与释放的总As 量也呈显著正相关，表明释放的As 主要来自胶体中铁氧化物中负载的As。WANG等的研究表明，水稻土中铁还原菌的丰度与Fe和As 释放量紧密相关。也有研究提出，微生物能够还原溶解结晶度低的铁氧化物，并将其转化为表面积更小的次生矿物，从而使提供的吸附位点减少，导致As 的释放。因此，自然环境中Fe 的循环转化可影响As 的迁移转化，进而影响As的生物可利用性。在初始pH=7条件下，JX-7 处理组受微生物转化作用Fe产生量较大，对pH 和总As影响更加显著，两参数间也具有显著正相关关系；且在该初始条件下，释放的As以还原态为主，As（Ⅲ）的浓度与pH 和Fe浓度呈显著正相关关系，说明胶体中铁氧化物还原转化对悬液酸碱性的改变也会对释放的As形态有一定影响。

表6 不同初始pH条件下胶体悬液中不同参数间的相关性Table 6 Correlation among different parameters in colloidal suspension under different initial pH conditions

4 结论

（1）初始pH 的设定对含As 土壤胶体中铁氧化物还原及As释放均有显著影响。在pH 为3 和7 的条件下，胶体悬液的pH、Eh 在微生物的介导下均发生变化，初始pH=3 时不利于微生物的生长，pH 与Eh 变化不明显，悬液中释放的As 主要为As（Ⅴ）；但在pH=7条件下，微生物活动增强并形成强还原环境，pH 上升，促进铁还原，造成吸附态As 向溶解态转化，从而释放As（Ⅲ）。

（2）Fe与As存在耦合释放关系，初始pH 与胶体悬液中Fe、总As 呈显著正相关关系，Fe与总As 也呈现正相关关系，且在中性环境中铁还原与As 释放效果更好。

（3）在中性环境条件下含As 土壤胶体中As 的释放受微生物对铁氧化物异化还原过程影响较大。