茉莉酸甲酯对小麦幼苗生长及镉积累的影响

2022-05-29冯文静高巍孙苗苗赵鹏康国章刘红恩秦世玉李畅睢福庆

农业环境科学学报 2022年5期

冯文静，高巍*，孙苗苗，赵鹏*，康国章，刘红恩，秦世玉，李畅，睢福庆

（1.河南农业大学资源与环境学院，郑州 450002；2.河南农业大学农学院，郑州 450046）

镉（Cadmium，Cd）是自然界中广泛存在的一种毒性较高的重金属。近几十年来，受工业“三废”长期排放、农业含镉污水的灌溉、化肥和农药的大量施用、重金属大气沉降不断增多等因素影响，重金属镉经过扩散、沉降并累积在农田中，导致农田土壤的镉污染情况日益严重。我国已有11 个省份和25 个地区涉及到了镉污染，污染面积达到2.8×10hm。植物有富集镉的能力，积累过量时会影响植株体内的各种生理生化代谢，如叶片叶绿素含量减少、细胞膜脂过氧化加剧、根系矿质营养元素吸收受到抑制等，阻碍农作物的正常生长发育，而且镉通过食物链传递会对动物和人类健康造成严重威胁。小麦在我国是仅次于水稻的第二大粮食作物，当小麦植株中镉浓度过量时，也会对小麦造成毒害，如生长迟缓、产量下降等，严重时甚至导致作物死亡，所以研究重金属镉对小麦的影响具有重要意义。

茉莉酸盐（JAs）是由亚麻酸通过十八烷酸途径合成的一类环戊酮化合物，包括茉莉酸甲酯（MeJA）和茉莉酸（JA）。JAs 在一些生物和非生物胁迫下的植物信号网络中有着重要作用。JAs 的外源施用对作物生长具有浓度效应，高浓度JAs 的外源施用会抑制植物生长和光合作用，加速衰老，如高浓度MeJA 的施用抑制了波斯菊在镉胁迫下干物质的积累，且浓度越大，抑制作用越严重；而低浓度JAs 的外源施用可以提高植物对非生物胁迫的抗性，可以通过触发渗透压脯氨酸和抗氧化酶的积累，缓解植物受到的Cu胁迫。KERAMAT 等发现，向大豆喷洒0.01 mmol·L或0.1 mmol·LMeJA 可通过降低MDA 和HO的含量以及增加抗氧化酶的活性来减轻镉诱导的损伤。0.01 mmol·L和0.1 mmol·LMeJA 也可以通过激活抗氧化系统和调节光合作用来缓解拟南芥镉和铜胁迫。此外，0.01 mmol·LMeJA 还可以通过显著减少镉在龙葵茎和根中的转运/积累来减轻镉毒性。0.01 mmol·LMeJA 可以通过阻抗镉吸收/转移到叶片、增加抗坏血酸浓度以及提高CAT和APX活性，保护秋茄幼苗免受镉胁迫。MeJA通过增强抗氧化剂和次级代谢产物的酶活性和基因（如苯丙氨酸解氨酶、多酚过氧化物酶、肉桂醇脱氢酶及溶氧酶基因）表达的增加缓解砷对甘蓝型油菜的氧化损伤。因此，外源施用JAs或者MeJA可以通过提高抗氧化酶活性、叶绿素含量和次生代谢产物以及降低MDA和ROS的含量等，有效减轻重金属对植物的伤害。

《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）中土壤重金属镉污染风险筛选值为0.3～0.6 mg·kg，水培试验中镉浓度的5µmol·L约等于土培体系下的0.56 mg·kg，浓度较合理。前期试验也表明，该剂量可以产生轻中度毒害表型且不致死，考虑到重金属镉对植物生长具有“低促高抑”的作用，本试验设置0.5 µmol·L和5µmol·L两个镉浓度。MeJA 对缓解植物逆境损伤、促进植物生长发育的有效浓度范围在0.01～500µmol·L。前期试验表明，1µmol·L和100µmol·LMeJA 对缓解小麦镉毒害效果显著，因此本试验设置1 µmol·L和100 µmol·L两个MeJA 浓度。本试验主要从植物的光合特性、根系形态，以及镉在植物体内的赋存形态等方面，探究叶面喷施MeJA 对镉胁迫下小麦幼苗生长发育及镉吸收转运的作用及机制，为进一步研究MeJA 缓解小麦镉毒害的生理机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试材料选用百农207 小麦（L.）种子，在蒸馏水中浸泡12 h，记为第0天，在育苗盆中培养7 d 至两叶一心期，第8 天移入Hoagland 营养液中，第10 天喷施含有0.05%吐温20 的MeJA，MeJA浓度为0、1 µmol·L和100 µmol·L（分别记作Me-JA-0、MeJA-1 和MeJA-100），第12 天进行镉胁迫处理，镉以CdCl形式加入营养液，镉浓度为0.5 µmol·L和5µmol·L（分别记作Cd 0.5和Cd 5），第28天采样。试验处理期间，每隔3 d更换一次营养液、喷施一次MeJA，每个处理均喷至叶面滴水为止，约为20 mL。试验共6 个处理，每个处理重复4 次，每个重复种植10株小麦幼苗。

1.2 样品采集

培养28 d 后，收获小麦植株，把地上部与根系分开，根系在2 mmol·L的MES（吗啉乙磺酸）溶液（0.5 mmol·LCaCl和2 mmol·LMES，pH=5.4 的混合溶液）中浸泡30 min，再用去离子水冲洗干净，吸干表面水分，一半植株样品在105 ℃的烤箱中杀青30 min，65 ℃干燥至恒质量，测定干物质量、镉含量。另一半植株样品置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于镉的化学形态分析。

1.3 测定指标

1.3.1 地上部及根系生物量

小麦根系在2 mmol·LMES 中浸泡30 min，根系与地上部用蒸馏水冲洗、擦干后，一起放至烘箱105 ℃杀青30 min，然后烘至质量恒定称干物质量。

1.3.2 光合参数的测定

镉处理后的第21天，在上午9：00—11：00之间使用光合作用-荧光测定系统（LI-6400XT，LI-COR，美国）测定小麦顶端向下第二片完全展开叶的净光合速率（Pn，以CO计）、气孔导度（Gs，以HO计）、蒸腾速率（Tr，以HO计）和胞间CO浓度（Ci，以CO计）。光合测定仪光源为红蓝光源，有效辐射强度设置为500 mol·m·s。

1.3.3 根系扫描

第28 天收获植株，将根系和地上部分开，根系用EPSON 全自动扫描仪扫描记录小麦的根系形态并获取根系图像，然后采用WinRHIZO 2009 根系扫描分析系统分析得出小麦幼苗的总根长、根表面积、根体积、平均根直径和根尖数等。

1.3.4 镉含量的测定

将烘干样品称取0.20 g，置于消煮管中，加入10 mL 配制好的HNO-HClO（∶=4∶1）混合溶液进行消煮。消化后的样品用蒸馏水定容至50 mL，然后使用火焰原子吸收分光光度计（ZEEnit 700，Analytik Jena AG，德国）测定样品镉含量，进而计算根系吸镉能力（整株镉积累量与根系生物量的比值）以及镉转移系数（地上与根部镉含量之比）。

1.3.5 镉的化学提取态含量测定

取小麦鲜样0.25 g 于研钵中，加入少量提取剂研磨成匀浆，并用相应提取剂洗涤进离心管中（∶=1∶10）。25 ℃条件下振荡22 h，3 000 r·min离心10 min，取上清液，向残渣中加入下一级提取剂进行提取。为提取完全，每一级提取重复3次，将3次提取的上清液收集在锥形瓶中，将其放在电热板上，在50 ℃下加热液体至5～10 mL，再加入HNO-HClO（∶=4∶1）进行消化，并用火焰原子吸收分光光度法与石墨炉原子吸收分光光度法测定各种形态的镉含量。

不同的提取剂对应植株中不同形态的镉的情况如下：80%乙醇（CHOH）对应硝酸/亚硝酸态镉、氯化镉、氨基酚镉；去离子水对应水溶态镉、有机酸配合态镉、Cd（HPO）；1 mol·LNaCl 对应果胶和蛋白质结合态镉；2%醋酸（CHCOOH）对应不溶性磷酸镉；0.6 mol·LHCl对应草酸态镉；其余为残渣态镉。

1.4 数据处理及分析方法

采用Excel 2010 软件进行整理分析试验数据并绘制雷达图，采用DPS 软件进行处理间差异显著分析，采用Origin 2018软件做图。

2 结果与分析

2.1 MeJA对镉胁迫下小麦生长的影响

如图1 所示，Cd 0.5 和Cd 5 处理植株生物量没有显著差异。在Cd 0.5和Cd 5处理下，小麦地上部及根系生物量随着MeJA 浓度的增大，呈现先增大后减小的趋势，且在MeJA 浓度为1µmol·L时达到峰值；与不喷施MeJA 相比，地上部增幅分别为30.2%和13.2%，根系增幅分别为28.4%和18.8%。由此可见，镉胁迫下喷施1µmol·LMeJA 可以显著提高小麦幼苗生物量。

图1 MeJA对镉胁迫下小麦地上部与根系生物量的影响Figure 1 Effects of MeJA on wheat growth and shoot and root biomass under Cd stress

2.2 MeJA对镉胁迫下小麦镉含量及吸收、转运的影响

如图2 所示，Cd 5 处理下地上部和根系镉含量以及根系吸镉能力均显著高于Cd 0.5 处理。两个镉处理条件下，镉含量随MeJA 浓度的提高呈现先减少后增加的趋势，在1µmol·L时达到最小值。Cd 0.5 处理下，1 µmol·LMeJA 显著降低地上部和根系镉含量，降幅分别为40.0%和39.0%；Cd 5 处理下，1µmol·LMeJA降低根部镉含量达21.3%。

MeJA可以显著降低根系吸镉能力（图2C），但具有促进镉向地上部转移的趋势（图2D）。相关性分析结果显示，根系镉含量（Cd 0.5和Cd 5）和地上部镉含量（Cd 5）与根系吸镉能力呈极显著正相关，相关系数分别为1.00、0.98和0.97。综上，喷施1µmol·LMeJA可以通过抑制小麦根系吸镉能力降低小麦植株镉含量。

图2 MeJA对小麦地上部和根系镉含量、转移系数和根系吸镉能力的影响Figure 2 Effects of MeJA on Cd concentrations in shoot and root，transfer factor and Cd uptake ability

2.3 MeJA对镉胁迫下小麦根系形态的影响

由表1 可知，未喷施MeJA 情况下，相较于Cd 0.5处理，Cd 5 处理可以显著增加小麦根直径约12.0%，对根长、根表面积和根体积没有显著影响。Cd 0.5 和Cd 5 处理下，MeJA 可增加根长、根表面积以及根体积，喷施浓度为1µmol·L时效果最好。Cd 0.5 和Cd 5 处理下根长增幅分别为38.7%和13.7%，根体积增幅分别为50.8%和21.8%。这表明MeJA 可以通过促进根系生长发育，缓解小麦镉毒害。

表1 MeJA对镉胁迫下小麦根系形态的影响Table 1 Effects of MeJA on root morphology of wheat under Cd stress

相关性分析结果表明，Cd 0.5处理下，根直径与根系吸镉能力（=-1.00**）、地上部镉含量（=-0.96**）和地下部镉含量（=-1.00**）呈现负相关；Cd 5 水平下，根长（=-0.95*）和根体积（=-0.95*）均与根系吸镉能力呈现负相关。表明MeJA可能通过影响幼苗根系形态建成来影响根系的吸镉能力，从而降低小麦幼苗镉含量。

2.4 MeJA对镉胁迫下小麦光合特性的影响

由表2 可知，未喷施MeJA 情况下，与Cd 0.5 相比，Cd 5处理抑制小麦幼苗的净光合速率、气孔导度、胞间CO浓度和蒸腾速率，分别降低了11.0%、7.4%、17.3%和15.2%。喷施MeJA 可提高Cd 0.5 及Cd 5 水平下幼苗的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率，降低胞间CO浓度。相关性分析结果表明，Cd 0.5 和Cd 5处理下，净光合速率与气孔导度（=1.00**和=0.79）和蒸腾速率（=1.00**和=0.81）呈正相关关系，与CO浓度（=-0.95 和=-0.85）呈负相关关系；且镉转移系数与气孔导度（=0.28 和=1.00**）和蒸腾速率（=0.25 和=1.00**）之间呈现正相关关系。结果表明，镉胁迫条件下，MeJA 可以通过提高气孔导度和蒸腾速率来提高幼苗的光合能力，但同时提高了镉从根系向地上部的迁移能力。

表2 MeJA对镉胁迫下小麦光合特性的影响Table 2 Effects of MeJA on photosynthetic characteristics of wheat under Cd stress

2.5 MeJA对小麦不同化学形态镉分布的影响

如图3 所示，小麦幼苗中镉主要的存在形态为氯化钠提取态、乙醇提取态、去离子水提取态和醋酸提取态，其余形态所占比例均小于1%。未喷施MeJA情况下，Cd 0.5、Cd 5 处理下，地上部分氯化钠提取态镉（95.2%、83.8%）＞醋酸提取态镉（1.8%、8.1%）＞去离子水提取态镉（1.6%、5.4%）＞乙醇提取态镉（0.9%、1.9%）；Cd 0.5、Cd 5 处理下，根系中氯化钠提取态镉分别为40.3%、31.3%，乙醇提取态镉分别为47.6%、14.1%，去离子水提取态镉分别为10.5%、52.7%，醋酸提取态镉分别为1.2%、1.0%。由此可见，果胶/蛋白质吸附镉是地上部镉的主要存在方式，根系镉则主要以游离镉、有机酸-镉复合物以及果胶/蛋白质吸附镉存在；相较于Cd 0.5，Cd 5 胁迫显著增加幼苗中有机酸-镉复合物和不溶性磷酸镉的比例，尤其提高了根系有机酸-镉复合物的比例。

由图3 可知，MeJA 可以显著影响在植物体内镉的化学形态，且存在剂量效应。MeJA 可以显著提高地上部乙醇+去离子水提取态镉比例，最高可提高605%，提高醋酸提取态镉高达149%，降低氯化钠提取态镉比例20%，显著降低根系乙醇+去离子水提取态镉比例44%，提高氯化钠和醋酸提取态镉比例，分别提高94%和157%。如表3 所示，相关性分析结果表明，MeJA 可以通过提高根系不溶性草酸镉和果胶/蛋白质吸附镉，缓解镉毒害，促进根系的生长和形态建成。除此以外，根据相关分析结果，Cd 0.5 处理下，镉的转移系数与根系有机酸-镉复合物比例呈显著正相关（=0.96*），表明1 µmol·LMeJA 显著降低了根系活性镉的比例，减少了镉从根系向地上部的转移。

表3 根系NaCl及HCl提取态镉占比与根系形态及根系生物量的相关性分析Table 3 MeJA-induced correlation between the proportion of NaCl and HCl extraction Cd oxidate and morphology/biomass of root

图3 MeJA对小麦不同化学形态镉分配比例的影响Figure 3 Effects of MeJA on the distribution of different Cd speciations in wheat

3 讨论

3.1 MeJA对小麦幼苗根系形态及镉吸收的影响

根系是植物吸收、代谢营养物质及毒性成分的主要器官，其形态关系到植物对养分、重金属的吸收能力，并表现出高度的响应环境变化的发育可塑性。镉胁迫对植物生长具有“低促高抑”的作用，中重度镉胁迫会导致根长、根表面积、根体积和总根尖数的下降，增加根系平均直径，即植物受到镉胁迫后表现出根变短变粗、根毛缺乏、侧根分枝减少等症状。根系生长的抑制主要是由于镉胁迫抑制根尖分生细胞的有丝分裂，导致染色体畸变，形成了表皮和皮层细胞以及细胞间隙的不对称。轻中度镉胁迫会引起根系出现代偿性增生，导致作物的根长、根表面积、根直径、根体积增加，促进对营养或水分的吸收，以维持作物的生长。本试验结果表明，镉处理仅增加了根系直径，对其他根系形态参数无显著影响，与郭俊娒等的研究结果一致。镉胁迫诱导根直径增加，一方面由于镉诱导小麦根部皮层细胞数量增多，另一方面由于镉胁迫下根毛及侧根减少，主根在根系中相对比重增大，使得根系平均直径增加。

根系的吸镉能力是指单位质量根的镉积累量。结果表明MeJA能够通过促进小麦幼苗根系形态建成降低根系吸镉能力，原因可能是MeJA 通过降低促进镉吸收的基因的表达，减少根系对镉的吸收，导致整株镉积累量下降，也可能是MeJA 促进酚类化合物等有机化合物的积累/分泌。据报道，洋甘菊植株地上部分酚类化合物的大量产生可以显著抑制茎中镍和镉的积累，MeJA 也可以通过增加倒卵形秋茄幼苗中的酚类化合物，抑制叶片对镉的吸收，因此MeJA 可能通过促进根系形态的建成，促进根系中酚类化合物的增加或者促进了根系向营养液中分泌酚类化合物，导致根系对镉的吸收能力下降。此外，根系形态的良好建成可能会使根系细胞膜的选择透过性更强，导致进入根系中的镉减少，即降低了根系吸镉能力。

3.2 MeJA对小麦幼苗气孔及镉吸收转运的影响

重金属胁迫会抑制植株的光合作用，进而影响干物质的积累。光合作用由气孔限制因子和非气孔限制因子共同控制，气孔促进CO/HO 交换开放和关闭，其开关主要与保卫细胞、辅助细胞和表皮细胞的形态相关；非气孔限制因子主要指CO的同化反应，负责将光能转化为化学能。FARQUHAR 等提出胞间CO浓度与净光合速率变化趋势的一致，可用于说明引起光合作用变化的主要原因为气孔限制因子，否则为非气孔限制因子导致，即叶肉细胞光合活性的改变。本试验结果表明，相对于0.5µmol·L镉处理，5µmol·L镉处理显著降低了小麦幼苗净光合能力、气孔导度和胞间CO浓度，表明镉胁迫主要是通过降低气孔导度影响了叶片光合能力。大量研究表明，重金属胁迫对植物光合作用的影响机制可能包括以下几个方面：引起K从保卫细胞流入辅助细胞，导致保卫细胞失去膨压，最终导致气孔关闭；抑制叶绿素的生物合成和Rubisco 活性；增加叶片中可溶性己糖浓度，抑制光合基因，降低CO同化速率。镉胁迫引发的Rubisco活性降低与镉取代碳酸酐酶的活性中心Zn有关。碳酸酐酶是在细胞内催化CO可逆水合反应的一种含锌金属酶，能够加速无机碳向羧化酶活性部位的扩散，提高羧化酶周围无机碳的浓度，从而增加CO的固定速率。

植物激素在提高镉胁迫条件下小麦光合能力、缓解镉毒害的过程中具有重要作用。脱落酸是气孔运动过程的主要调控因子，并与茉莉酸和水杨酸等植物激素发生协同作用。大量试验表明，MeJA 可以通过调节气孔导度、蒸腾速率和叶绿素合成代谢等因素来参与植物的光合作用，缓解镉对植物生长的抑制作用。如表2 所示，0.5 µmol·L镉胁迫下喷施MeJA 显著提高了小麦幼苗的净光合速率、气孔导度，但显著降低胞间CO浓度；5µmol·L镉胁迫下，喷施MeJA 显著提高小麦叶片净光合速率，可能是由于小麦幼苗在较高镉浓度下培养周期较短，喷施MeJA 对气孔导度、胞间CO浓度及蒸腾速率的促进或抑制效果并不显著，但气孔导度与蒸腾速率较清水对照有升高趋势，胞间CO浓度有下降趋势，可以说明镉胁迫下喷施MeJA主要是通过调节非气孔限制因素促进净光合速率的提高，其原因可能是MeJA 提高了Rubisco活性，提高了CO与RuBP 的羧合的同化速率，进而导致胞间CO浓度的降低。相似研究表明，镉胁迫条件下，外源SA和MeJA可以提高植物叶片的Rubisco活性，提高CO固定率。气孔行为不仅是维持光合作用的关键点，也会通过影响蒸腾速率，影响植物体内水分利用效率和植物体内矿质营养元素的转运，同时土壤含水量也是影响蒸腾速率的重要原因之一，本研究是基于营养液培养，水分充足，因此添加镉处理及喷施MeJA对蒸腾速率的影响均未达到显著。本试验研究表明，镉胁迫条件下，MeJA 可以通过提高气孔导度和蒸腾速率，提高幼苗的光合能力，但同时增加了镉从根系向地上部迁移的可能性。

3.3 MeJA对小麦幼苗镉赋存形态及镉吸收转运的影响

MeJA 除了影响根系形态、光合作用、氧化，也可以通过影响重金属的赋存形态有效减轻重金属对植物的伤害（表2）。镉在植物体内的赋存形态会影响镉在植物体内的迁移转化特征，以及镉对植物的毒害程度。本试验采用分级提取的方式，乙醇主要提取无机态镉、氨基酸态镉等物质，去离子水主要提取水溶有机酸提取态镉等，氯化钠主要提取与蛋白质结合或吸附态以及果胶酸结合态镉等，醋酸主要提取难溶于水的磷酸镉，盐酸提取草酸态镉等。其中乙醇和去离子水提取态镉生物毒性和迁移活性显著高于不溶解的磷酸镉和草酸镉，易使植物受到毒害。

本试验结果表明，镉的化学形态分配特征具有显著的组织特异性。幼苗地上部分80%以上的镉可能主要与果胶上的羧基和蛋白质巯基发生结合，进而阻碍镉进入原生质；根系中的镉则主要以游离镉、有机酸-镉复合物以及果胶/蛋白质吸附镉的形式存在。地上部镉含量与不溶性磷酸镉比例（=0.91**）、根系镉含量与残渣态镉比例（=0.82**）呈显著正性相关，表明液泡中不溶性磷酸镉的形成可能是小麦幼苗应对镉胁迫的应答机制之一。磷肥的施用可以降低镉的转移系数。MeJA 可以通过改变根系中镉的赋存形态影响镉的迁移及毒害能力。1µmol·LMe-JA能够显著降低根系活性镉的比例，抑制镉从根系向地上部的迁移，并通过提高不溶性草酸态镉和果胶/蛋白质吸附态镉的比例缓解根系毒害，有助于根系形态建成。