背角无齿蚌幼蚌不同组织的铜积累特征

2022-05-29刘凯陈修报刘洪波姜涛杨健

农业环境科学学报 2022年5期

刘凯，陈修报，刘洪波，姜涛，杨健，*

（1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，中国水产科学研究院长江中下游渔业生态环境评价和资源养护重点实验室，江苏无锡 214081）

重金属污染严重威胁我国淡水渔业水域生态环境健康，Cu 已经成为其中污染最为严重的重金属之一。《2019 年中国渔业生态环境状况公报》指出我国江河重要渔业水域中Cu 的超标率为7.5%，湖泊、水库重要渔业水域中Cu 的超标率高达11.0%。Cu 污染具有毒性强、难以降解、易于沿食物链发生生物放大等特点，因此，研究水体Cu污染的生物监测对淡水生态系统具有重要意义。双壳贝类对重金属的耐受性较强，且对重金属具有低代谢和高富集的特性，是一种良好的水体重金属监测评价指标生物。目前，国际上利用双壳贝类对水域环境进行生物监测的研究已有很多，早在1970 年美国国家海洋和大气管理局就选用紫贻贝作为指标生物进行“贝类观察”研究并沿用至今。

背角无齿蚌（）是起源于我国长江和黑龙江流域，现今已在全球广泛分布的双壳贝类。2003 年本课题组率先选用背角无齿蚌对太湖水域进行系统监测，而后经过十几年的研究发展，已经逐渐形成了一套较为完整的以背角无齿蚌为指示生物的“淡水贝类观察”研究体系。研究表明，背角无齿蚌富集能力明显高于其他淡水双壳贝类，其各组织内的重金属分布情况也不同，含量排列顺序为鳃＞内脏团＞外套膜＞斧足＞闭壳肌。周晏敏等针对嫩江3 种蚌类对重金属富集能力的研究发现，背角无齿蚌对重金属的积累能力最强，不同组织对重金属的积累能力也有所不同，各组织Cu 的积累能力顺序为鳃＞外套膜＞斧足。背角无齿蚌对水体Cu的去除率是三角帆蚌（）的1.2 倍。夏天翔等研究背角无齿蚌和三角帆蚌发现，这两种蚌类体内重金属的积累规律为鳃＞外套膜＞斧足＞壳，除壳外，背角无齿蚌其他组织中的重金属含量均大于三角帆蚌。

本课题组前期研究成果表明，背角无齿蚌幼蚌比成蚌对Cu 毒性更加敏感，Cu 对幼蚌的96 h-EC为3.4 mg·L，而成蚌的96 h-EC为22.1 mg·L，约是幼蚌的6.5 倍。目前有关幼蚌对Cu 的组织积累特征研究仍较薄弱，因此本研究选定背角无齿蚌幼蚌为实验对象，分析背角无齿蚌幼蚌不同组织（鳃、斧足、外套膜、消化腺和其余组织）的Cu 积累特征。本研究旨在为背角无齿蚌作为“淡水贝类观察”的指示生物在组织积累特征方面提供相关资料，从而为淡水环境Cu污染监测评估生物标志物的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究所采用的背角无齿蚌幼蚌均源自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉实验基地，人工养殖以及水环境条件参考文献[14]。

1.2 暴露实验

本研究参照在国际上被广泛认可的美国“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”研究方法，开展Cu 对背角无齿蚌幼蚌的毒性暴露实验。

选取大小相近、健康无病、体表无伤的1 龄幼蚌，壳长为（6.4±0.4）cm，质量为（25.1±5.0）g。用刷子清洗蚌壳附着物后，将蚌暂养于实验室水族箱中2 周以适应实验条件，每日投喂一次小球藻（），投喂量约为4×10个·L。实验开始前3 d 停止投喂，排空幼蚌肠道内杂物。根据本课题组前期研究结果（Cu 对背角无齿蚌幼蚌96 h-EC为3.4 mg·L）以及我国《渔业水质标准》（GB 11607—1989）中Cu 限量（0.01 mg·L），用人工配制软水（pH 值7.3～7.5、硬度40～48 mg·L、碱度30～35 mg·L）配制5个Cu 理论浓度（2.0、1.0、0.1、0.01、0.005 mg·L），另设置不添加Cu 的对照组，每组设置3 个平行。水体Cu 的实测浓度分别为2.1、1.0、0.1、0.01、0.003 mg·L。鉴于水体Cu 的实测浓度和理论浓度总体很接近，本实验应用理论浓度来表述。本实验在贝类重金属暴露系统中进行，以一次成型的10 L 玻璃缸为容器，按照每只蚌500 mL 标准，每缸加入16 只幼蚌，添加8 L 人工配制软水。实验期间水温控制在（20±1）℃，亮暗比为16∶8，光强为1 000 lx，溶氧量＞5.0 mg·L。为保持溶液Cu浓度稳定，在24、48、72、96 h分别从各浓度组取3 只幼蚌，同时更换一次溶液。实验期间不投喂，并根据本课题组前期建立的背角无齿蚌幼蚌判断死亡的方法（幼蚌双壳张开且用玻璃棒刺激不闭壳即判断为死亡）监测幼蚌存活情况，本实验期间无幼蚌死亡。

1.3 样品制备与测定

样本制备：将蚌样从冰箱取出放室温下解冻，用不锈钢解剖刀和剪刀分离出整个软组织，然后分别取出鳃、斧足、外套膜、消化腺和其他组织，用Milli-Q 水将组织清洗6遍，称取质量后放入80 ℃的干燥箱中烘24 h至质量恒定，计算湿质量和干质量比率，以便干、湿组织中Cu 含量间的换算。鳃、外套膜、斧足、消化腺和其余组织的平均干湿比分别为0.088、0.066、0.082、0.090和0.103。使用玛瑙研钵将组织研磨至粉末状后用称量纸包好放入干燥器中保存。

样本消解和测定：精准称量样本于酸洗后的特氟隆消解管中，然后加入5 mL 纯硝酸，使用T260 微波消解仪按照设定温度10 min（120 ℃）、15 min（170 ℃）和15 min（170 ℃）将样品彻底消解，消解后转移到酸洗烘干后的特氟隆定容瓶中，加入Milli-Q 水稀释至100 mL。应用ICP-MS 测定蚌样中重金属Cu 含量。通过标准添加回收确认仪器的测量精度，Cu 的回收率在104%～109%。

1.4 统计分析

本研究中背角无齿蚌的Cu含量（以干质量计）均以平均值±标准差（means±SD）表示。数据分析采用SPSS 26.0 软件，暴露组与对照组的差异性检验采用单因素方差分析（One-way ANOVA），＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 鳃中Cu积累

经Cu 暴露后，在24、48、72、96 h 时，幼蚌鳃中Cu含量随着暴露浓度的升高总体呈现出增加的趋势（图1）。0.005 mg·L和1.0 mg·LCu 暴露组随暴露时间的延长Cu 含量逐渐增加。24、48、72、96 h 时，0.01、0.1、2.0 mg·LCu 暴露组与对照组相比差异显著（＜0.05），且3组Cu含量均随暴露时间的延长先增加后减少，最高值均出现在72 h，分别为（20.69±5.75）、（17.58±4.17）µg·g和（319.04±6.77）µg·g。72 h时，2.0 mg·L暴露组中鳃的Cu含量达到最大值，为（319.04±6.77)µg·g（＜0.05）。

图1 背角无齿蚌幼蚌鳃组织Cu含量Figure 1 Cu content in the gill of juvenile A.woodiɑnɑ

2.2 外套膜中Cu积累

外套膜经Cu 暴露后，在24、48、72、96 h 时的Cu含量随着暴露浓度的升高总体呈现出增加的趋势（图2）。0.005 mg·LCu 暴露组在24、48、72 h 时的Cu 含量变化不显著，在96 h时有明显增加。0.01 mg·L和1.0 mg·LCu 暴露组随暴露时间的延长Cu 含量呈现出增加趋势，最高值均出现在96 h（＜0.05）。0.1 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露组随暴露时间的延长Cu含量先增加后减少，最高值均出现在72 h，分别为（30.05±3.86）µg·g和（669.20±32.42）µg·g（＜0.05）。当Cu暴露时间为72 h时，2.0 mg·LCu 暴露组中外套膜的Cu 含量达到最大值，为（669.20±32.42）µg·g（＜0.05）。

图2 背角无齿蚌幼蚌外套膜组织Cu含量Figure 2 Cu content in the mantle of juvenile A.woodiɑnɑ

2.3 斧足中Cu积累

如图3 所示，在Cu 暴露24、48、72、96 h 时，幼蚌斧足中Cu含量随暴露浓度的升高总体呈现出增加趋势，0.005、0.01 mg·L以及0.1 mg·LCu 暴露组与对照组相比差异不显著，而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu暴露组与对照组相比差异显著（＜0.05）。96 h 时，在2.0 mg·LCu 暴露组中幼蚌斧足的Cu 含量达到最大值，为（629.95±26.23）µg·g（＜0.05）。

图3 背角无齿蚌幼蚌斧足组织Cu含量Figure 3 Cu content in the axe-shaped foot of juvenile A.woodiɑnɑ

2.4 消化腺中Cu积累

图4为消化腺经24、48、72、96 h Cu 暴露后的组织Cu 含量。幼蚌消化腺的Cu 含量随暴露浓度的升高总体呈现出升高的趋势。24 h 和48 h 时，0.005、0.01、0.1、1.0（24 h除外）、2.0 mg·LCu暴露组与对照组相比Cu 含量差异显著（＜0.05）。72 h 时，在2.0 mg·LCu 暴露组中幼蚌消化腺的Cu 含量达到最大值，为（642.97±29.62）µg·g（＜0.05）。

图4 背角无齿蚌幼蚌消化腺组织Cu含量Figure 4 Cu content in the digestive gland of juvenile A.woodiɑnɑ

2.5 其余组织中Cu积累

如图5 所示，经24、48、72、96 h 的Cu 暴露，幼蚌其余组织的Cu含量随暴露浓度的升高总体上呈现出增加的趋势。在24 h和48 h时，各暴露组与对照组相比差异显著（＜0.05）。2.0 mg·LCu 暴露组Cu 含量随暴露时间的延长呈现出先增加后减少的趋势，最高值出现在72 h时，为（556.51±17.17）µg·g（＜0.05）。

图5 背角无齿蚌幼蚌其余组织Cu含量Figure 5 Cu content in other tissues of juvenile A.woodiɑnɑ

2.6 整个软组织中Cu积累

根据不同组织（鳃、外套膜、斧足、消化腺、其余组织）的Cu 含量及其质量，计算出整个软组织的Cu 积累量。如图6 所示，经Cu 暴露后，在24、48、72、96 h时，幼蚌整个软组织Cu 含量随暴露浓度的升高整体上呈现出升高趋势。其中0.01 mg·LCu 暴露组Cu含量随暴露时间的延长呈现出逐渐增加的趋势。而0.1 mg·L和2.0 mg·LCu暴露组Cu含量随暴露时间的延长呈现出先增加后减少的趋势，最高值均出现在72 h，分别为12.42µg·g和524.76µg·g。当暴露时间为72 h时，在2.0 mg·LCu暴露组中幼蚌整个软组织的Cu含量达到最大值，为524.76µg·g。

图6 背角无齿蚌幼蚌整个软组织Cu含量Figure 6 Cu content in whole soft tissue of juvenile A.woodiɑnɑ

3 讨论

背角无齿蚌等双壳贝类体内重金属的积累情况可以直接反映出水体重金属的污染程度。研究发现，双壳贝类对Cu等重金属的积累能力与暴露浓度和暴露时间直接相关，但同时又受到物种差异、个体差异、酸碱度、温度等很多其他生物和非生物因素的影响。如在相同水环境中背角无齿蚌软组织Cu积累量是斑马贻贝（）的7 倍；由于H与Cu竞争结合位点，斑马贻贝对水体中Cu的吸收率会随着水环境pH 从8.3 降低到6.5 而逐步下降。由本研究可知，背角无齿蚌幼蚌整个软组织的Cu 含量随Cu 暴露浓度的增加而增加，这与夏天翔等对背角无齿蚌和三角帆蚌的Cu 积累研究结果一致。井维鑫在研究Cd 暴露背角无齿蚌时也发现了类似结果。本实验结果表明，幼蚌软组织的Cu 含量在0.1 mg·L和2.0 mg·LCu暴露96 h后出现明显降低。这与郭远明等研究泥蚶和菲律宾蛤仔的结果相似，泥蚶和菲律宾蛤仔体内Cu 含量均在第1 天上升，在第3 天下降。推测可能与双壳贝类动物体内的解毒机制有关：其一，受到环境胁迫时，双壳贝类会出现增加闭壳时间、降低缩壳频率等行为，减少软组织与外界水体的接触；其二，当双壳贝类受到外界刺激时会增加体表黏液分泌量；其三，金属硫蛋白可以与Cu等重金属结合起到解毒作用。

双壳贝类不同组织Cu积累能力与其吸收途径有关：一是鳃通过滤水吸收溶解态的Cu，然后Cu 随血液循环被输送到其他组织；二是外套膜或其他体表可以直接与水体接触的软组织通过渗透作用吸收溶解态的Cu；三是幼蚌的摄食过程，使得食物中的Cu 以及颗粒态的Cu经过消化系统被机体吸收。鳃、外套膜、斧足、消化腺和其余组织是背角无齿蚌幼蚌整个软组织的关键组成部分（图7）。值得注意的是，幼蚌各个组织Cu 含量并不相同。本实验结果表明，经24 h Cu 暴露，暴露组各组织Cu 含量与对照组相比均有所增加，Cu 含量的排列顺序为外套膜＞鳃＞斧足＞消化腺＞其余组织。其中鳃和外套膜反应最为灵敏，在24 h 时组织Cu 含量显著增加，且明显大于斧足和消化腺，后随暴露时间的延长逐渐升高，鳃和外套膜分别在96 h和72 h时浓度值达到最大值。在96 h时，各组织Cu 含量的排列顺序为斧足＞消化腺＞其余组织＞外套膜＞鳃。

图7 背角无齿蚌幼蚌（＞1龄）及成蚌的内部结构示意图[6]Figure 7 The schematic internal structure diagram of juvenile（＞one-year old）and adult A.woodiɑnɑ[6]

鳃作为背角无齿蚌等双壳贝类的呼吸器官，是机体与外界水体进行物质交换最为频繁的组织，同时也是短期富集重金属的重要组织。研究表明，Cu 可以通过不同方式转运到鳃中，例如主动运输、被动扩散以及与金属硫蛋白结合等方式。本实验发现，经96 h Cu 暴露，鳃Cu含量总体上随暴露浓度的增加和时间的延长呈现升高趋势，该结果在其他双壳贝类中也有发现，如孟晓林在研究虾夷扇贝时也发现了相似的结果。本研究结果显示，在24 h 时，各暴露组鳃组织Cu含量显著增加，其中0.005、0.01、0.1、1.0、2.0 mg·LCu 暴露组Cu含量分别是对照组的1.7、3.9、5.5、7.8、31.9倍，相较于其他组织反应较为灵敏。这可能与鳃的呼吸功能有关，而且鳃与水体接触面积大，Cu进入血液的距离短。然而，在96 h时Cu含量下降约20%。李涌泉在研究Cd暴露背角无齿蚌时发现了相似的现象，16.86 mg·L和33.72 mg·L浓度组的Cd含量随暴露时间延长先升高后降低，最高含量出现在48 h时。推测可能是因为Cu含量达到饱和状态后，Cu会随血液循环转运到其他组织。

外套膜是外套腔的组成部分，其与水体直接接触，具有分泌珍珠质及促进性腺发育等功能。本研究表明，暴露24 、48 h 和72 h 时，外套膜在0.005、0.01、0.1、1.0 mg·LCu 暴露组的Cu 含量均大于斧足和消化腺，且随暴露时间的延长呈上升趋势，最大值出现在72 h，为669.20 µg·g，这主要与外套膜是幼蚌与水体接触面积最大的软组织有关，水体中的Cu可以直接通过渗透作用进入组织，所以在短时间内即发生大量富集。

斧足作为幼蚌的运动器官，主要由大量肌肉细胞组成。本研究表明，经96 h Cu 暴露，斧足在0.005、0.01 mg·L和0.1 mg·LCu 暴露组的Cu 含量与对照组相比有所增加，但随暴露时间的延长Cu 含量变化并不显著；而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露组随暴露时间的延长Cu 含量显著增加，最大值出现在96 h时2.0 mg·LCu暴露组，为629.95µg·g。96 h时，斧足Cu 含量显著高于其他组织，推测可能是由于暴露浓度过高引起斧足上皮细胞受损，上皮细胞作为斧足的第一层保护屏障被破坏后，斧足内部组织细胞直接与水体接触，Cu 更容易进入组织中，导致组织Cu 含量较高，但这需要利用组织切片技术进行深入探究。姜会超等研究菲律宾蛤仔时也得到了相似的结果，即经暴露后斧足Cd含量明显高于鳃和外套膜。

消化腺是幼蚌重要的消化器官，同时也是解毒器官。本研究发现，经96 h 暴露，0.005、0.01、0.1 mg·LCu 暴露组Cu 含量整体变化不显著，总体呈现出随暴露浓度升高而升高的趋势，最高含量均出现在48 h，这可能与消化腺不直接与水体接触和其解毒作用有关。而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露组Cu 含量相较于其他暴露组显著增加，并且是除外套膜以外Cu含量最高的组织，这说明消化腺是Cu 积累的重要器官。井维鑫在以Cd 暴露背角无齿蚌的研究中发现，消化腺是除肾脏外Cd 含量最高的组织之一。相似的结果也在南极扇贝（）中发现。本研究结果表明，48～72 h，消化腺Cu含量急剧升高，72 h时的Cu含量约是48 h时的18倍，推测这可能与暴露期间不投喂饲料，Cu 只能通过血液循环进入消化腺组织有关，所以前期增长缓慢，后随暴露时间的延长，Cu 从其他组织随血液循环被转运到消化腺中，诱导消化腺金属硫蛋白表达量增加，Cu 与金属硫蛋白结合并蓄积在消化腺中导致组织Cu含量显著升高。