紫云英苷对大肠杆菌的抑制作用及其机制研究*

温燕龙，李文云，张 楠，苏荣镇，夏继蓉，李凌飞,3 ，田 洋,3

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，云南农业大学，云南 昆明 650201；3.教育部食药同源资源开发与利用工程中心，云南农业大学，云南 昆明 650201)

大肠杆菌(Escherichia coli)为革兰氏阴性菌，是食品中常见的腐败菌和致病菌，在自然环境中广泛存在，传播途径较广。大肠杆菌会引起腹泻、腹膜炎、结肠炎、菌血症和尿路感染等疾病，严重者甚至发生肾衰竭和癌症[1-2]。因此，大肠杆菌已成为食品生产加工污染防控的一大难题。

生物膜是微生物为适应环境，通过分泌大量胞外基质(extracellular polymeric substance，EPS)将菌体自身包裹在立体结构中而形成的菌体聚集体[3]。生物膜是细菌为提高生存几率所产生的特有生命现象。形成生物被膜的细菌大多具有抵御抗生素杀伤和逃避宿主机体免疫系统清除的特性，这些特性会造成机体感染反复发作和难以根治的后果[4]。目前用于临床治疗的药物主要是抗生素，但长期使用抗生素治疗易导致产生超级细菌，人被感染后很难治愈甚至死亡。随着抗生素的滥用和全球耐药环境的不断恶化，寻找抗生素的替代品已成为当前研究的热点。

辣木富含酚类物质，辣木叶和辣木籽中均含有不同种类的多酚类物质[5-6]。辣木叶中的酚类物质具有较好的抑菌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]和降脂[11]等生物学活性。植物多酚类物质主要通过影响菌体壁膜和细胞器的结构与功能[12-15]、抑制大分子物质合成和干扰菌体能量代谢[16]等方式抑制微生物生长。由于植物多酚抑菌机制与多酚种类及微生物种类密切相关，因此其作用机制仍未被完全探明。近年来，随着“绿色食品”和“无化学添加”的流行，对天然植物提取物安全性和抗菌活性的研究日益增多。紫云英苷又名山奈酚-3-葡萄糖苷，是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于多种植物和中草药中，如辣木[17]、荷叶[18]、百蕊草[19]和杜仲[20]等。紫云英苷具有抑菌[21]、抗炎[22]、抗氧化[23]和抗癌[24]等生物活性，但关于其对大肠杆菌的作用机制尚未见报道。

本研究以大肠杆菌为供试菌，探讨4 种辣木多酚单体成分(紫云英苷、绿原酸、芦丁和金丝桃苷)对大肠杆菌的抑制作用，并以半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)效果最好的紫云英苷为例，初步探讨其抑菌机制，以期为紫云英苷应用于食品防腐提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

大肠杆菌(E.coliCICC20658)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 材料与试剂

紫云英苷购自成都德瑞克生物技术有限公司，纯度大于98%；绿原酸、芦丁和金丝桃苷购自北京源叶生物科技有限公司，纯度大于98%；二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司；营养肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备

参考姚志蕊[25]的方法，将大肠杆菌菌株从甘油管中取出，营养肉汤活化2 次后，采用细菌比浊测定法[26]调整供试菌密度为107CFU/mL，4 ℃保存备用。

1.2.2 半数抑制浓度(IC50)的测定

参考林震等[27]和BISIGNANO 等[28]的方法并稍作改进，测定4 种辣木多酚单体成分(紫云英苷、绿原酸、芦丁和金丝桃苷)对大肠杆菌的IC50。将多酚单体分别加入大肠杆菌菌悬液中混匀，使其终浓度分别为25、50、100、200、400、800 和1 600 μmol/L，以每孔载液量200 μL加入96 孔板，37 ℃避光培养24 h 后，采用多功能酶标仪(美国Moleculart Devices)在OD600处测定其吸光度值，空白对照组为等量无菌水代替多酚单体加入菌悬液中。通过SPSS 20 软件中的Probit 回归模型计算IC50值。

1.2.3 紫云英苷对大肠杆菌生长曲线的影响

参考吴遵秋等[29]的方法并稍作改进。将紫云英苷加入到大肠杆菌菌悬液中混匀，使其终浓度分别为400、800 和1 600 μmol/L，以每孔载液量200 μL 加入96 孔板，空白对照组为等量无菌水代替紫云英苷加入菌悬液中。37 ℃避光培养24 h 后，OD600处测定其吸光度值，绘制生长曲线。

1.2.4 紫云英苷对大肠杆菌生物膜的影响

(1)生物膜结晶紫染色

参考杜文芳[30]和DJORDJEVIC 等[31]的方法并稍作改进。将紫云英苷加入到大肠杆菌菌悬液中混匀，使其终浓度分别为200、400 和800 μmol/L，以每孔载液量200 μL 加入96 孔板，空白对照组为等量无菌水代替紫云英苷加入菌悬液中。37 ℃避光培养24 h 后，弃菌液，PBS 漂洗2 次，37 ℃干燥30 min；然后取0.1%结晶紫染液150 μL 于37 ℃染色15 min，弃染色液，PBS 洗涤生物膜2 次，直至阴性对照孔无过量染色；37 ℃干燥30 min，用200 μL 95%乙醇于37 ℃过夜脱色；最后在OD595处测定其吸光度值，记录并分析数据。

(2)菌体生物膜粘附性测定

参考WEI 等[32]的方法测定生物膜粘附性。将不同浓度的紫云英苷与菌液混合后加入含有细胞爬片的12 孔细胞培养板中。37 ℃避光培养24 h 后，弃菌液，PBS 漂洗2 次；用2.5%戊二醛浸泡过夜，乙醇梯度脱水(30%、50%、70%、80%、90%和100%)，镀金后用扫描电子显微镜进行拍摄。

1.2.5 紫云英苷对大肠杆菌细胞膜透性的影响

通过测定核酸和蛋白质泄漏量确定紫云英苷对大肠杆菌细胞膜透性的影响。参考CUI 等[33]的方法，取对数期菌液，用PBS 离心洗涤后重悬菌体，将紫云英苷加入到菌悬液中使其终浓度为200 和400 μmol/L，混匀后37 ℃避光培养4 h，离心收集上清加入到96 孔UV 紫外检测酶标板中[34]，分别于OD260和OD280处测定其吸光值，即为核酸和蛋白质的泄漏量。

1.2.6 紫云英苷对大肠杆菌菌体结构的影响

参考XU 等[35]的研究方法探究紫云英苷对大肠杆菌菌体结构的影响。取对数期菌液，用PBS 离心洗涤后重悬菌体，加入紫云英苷使其终浓度为200 和400 μmol/L，对照组加入无菌水，避光恒温培养12～18 h；然后收集菌体，加入2.5%戊二醛固定过夜，随后用PBS 漂洗2 次，乙醇梯度脱水(30%、50%、70%、80%、90%和100%)；最后烘干，镀金并在FlexSEM1000 扫描电镜下(日本日立高新公司)观察。

1.2.7 数据统计与分析

使用GraphPad Prism 5.0 和WPS 软件进行数据分析，两组间比较采用独立t检验(两尾法)，以P＜0.05 为显著性检验标准。

2 结果与分析

2.1 4 种辣木多酚单体的半数抑制浓度(IC50)

由图1 可知：与对照组相比，4 种单体对大肠杆菌都具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性。4 种辣木多酚单体的IC50值大小依次为：金丝桃苷(676 μmol/L)＞绿原酸(605 μmol/L)＞芦丁(588 μmol/L)＞紫云英苷(490 μmol/L)。因此，筛选抑制效果最好的紫云英苷进一步探究其作用机制。

图1 4 种辣木多酚单体对大肠杆菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of four Moringa oleifera polyphenol monomers on Escherichia coli

2.2 紫云英苷对大肠杆菌生长曲线的影响

由图2 可知：与对照组相比，400 μmol/L 紫云英苷对大肠杆菌生长曲线的抑制作用不明显，800 和1 600 μmol/L 紫云英苷对大肠杆菌的生长都具明显的抑制作用，且随着紫云英苷浓度的增大，抑制作用逐渐增强。

图2 紫云英苷对大肠杆菌生长曲线的影响Fig.2 Effect of astragalin on the growth curve of E.coli

2.3 紫云英苷对大肠杆菌生物膜的影响

2.3.1 紫云英苷抑制大肠杆菌生物被膜的形成

由图3 可知：与对照组相比，经过200、400和800 μmol/L 紫云英苷处理后的大肠杆菌生物膜形成均有所降低，其中800 μmol/L 紫云英苷处理时大肠杆菌生物膜形成极显著降低(P＜0.001)，表明紫云英苷能显著抑制大肠杆菌生物膜的形成。

图3 紫云英苷对大肠杆菌生物膜形成的影响Fig.3 The effect of astragalin on E.coli biofilm

2.3.2 紫云英苷降低大肠杆菌生物膜粘附性

由图4 可知：37 ℃培养时，生物膜上附着致密的大肠杆菌聚集体；与对照组相比，400 μmol/L紫云英苷处理后的大肠杆菌数量明显减少，生物膜的粘附性也有所下降。

图4 紫云英苷对大肠杆菌生物膜粘附性的影响Fig.4 Effect of astragalin on the biofilm adhesion of E.coli

2.4 紫云英苷对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

由图5 可知：经200 和400 μmol/L 紫云英苷处理过的大肠杆菌，其核酸和蛋白质泄漏极显著上升(P＜0.001)，表明紫云英苷处理后，大肠杆菌的细胞膜通透性增大，导致大分子的核酸和蛋白质泄漏到胞外。

图5 紫云英苷对大肠杆菌核酸泄漏(a)和蛋白质泄漏(b)的影响Fig.5 Effect of astragalin on the nucleic acid leakage(a)and protein leakage(b)from E.coli

2.5 紫云英苷对大肠杆菌菌体结构的影响

由图6 可知：与正常对照组相比，400 μmol/L紫云英苷处理过的大肠杆菌，其菌体结构遭到了破坏。正常大肠杆菌菌体呈杆状，圆润饱满。400 μmol/L 紫云英苷作用于大肠杆菌后，菌体表面较为粗糙，出现了褶皱和塌陷。

图6 紫云英苷对大肠杆菌菌体结构的影响Fig.6 Effect of astragalin on the structure of E.coli

3 讨论

本研究检测了4 种辣木多酚单体(紫云英苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷)对大肠杆菌的抑制作用。结果表明：4 种多酚单体对大肠杆菌均具有抑制作用，且抑菌作用具有浓度依赖性。孙洲悦等[7]研究发现：经过工艺优化提取的辣木叶总多酚能够抑制曲霉菌、毕赤酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长，这与本研究结果相似，但上述研究未进行辣木多酚单体抑菌活性的研究。李美萍等[36]和纪晓花[37]的研究发现：从细叶韭花和荷叶中提取的紫云英苷对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，但目前关于紫云英苷对大肠杆菌的抑制作用及其机制研究尚未见报道。本研究生长曲线研究结果表明：400、800 和1 600 μmol/L紫云英苷对大肠杆菌的生长具有抑制作用，且随浓度增加，抑菌效果越明显。

生物膜是由外泌蛋白、胞外多糖和胞外DNA 等多种成分组成的胞外聚合物，是细菌生长过程中形成的自我保护屏障。王心磊[38]研究发现：超声技术能够有效清除大肠杆菌O157:H7 的生物膜，并降低大肠杆菌O157:H7 生物膜的粘附性。刘亚文[39]研究发现：浓度为200 和400 μmol/L的苯乳酸、乳酸和柠檬酸可普遍抑制大肠杆菌生物膜的形成，并使菌株生物膜的厚度大大降低。有机酸通过未解离的分子在细胞膜上扩散，然后在细胞内解离和释放质子以抑制微生物生长或导致其死亡[40]。本研究表明：200、400 和800 μmol/L紫云英苷能显著抑制大肠杆菌生物膜形成，其中800 μmol/L紫云英苷可明显降低大肠杆菌生物膜的粘附性。

细胞膜是保护细胞的重要屏障，当细胞膜被破坏时，胞内大分子物质会泄漏到胞外[36]。因此，胞外物质的泄漏量是评价细胞膜完整性的重要指标。200 和400 μmol/L 紫云英苷作用于大肠杆菌后，上清液中的OD 值显著上升，表明紫云英苷破坏了大肠杆菌细胞膜的通透性，导致大分子核酸和蛋白质的泄漏。DIAO 等[41]研究发现：细胞内容物大量渗出，细胞质膜可能发生不可逆的损伤，导致细胞成分如DNA 和RNA 等一些必需分子丢失，导致细胞死亡。本研究中，扫描电镜结果表明：400 μmol/L 紫云英苷作用于大肠杆菌菌体后，使菌体表面变得粗糙，出现褶皱和塌陷。

4 结论

紫云英苷能够抑制大肠杆菌生长，通过改变大肠杆菌细胞膜通透性、增加核酸和蛋白质泄漏、抑制生物被膜合成以及改变细菌形态结构来影响大肠杆菌新陈代谢，从而起到抑菌作用。本研究为紫云英苷应用于食品防腐奠定了理论基础。