贵州小麦春化和光周期基因分布及其对抽穗期和开花期的效应分析*

陈宇轩，任明见,2，李鲁华,2，徐如宏,2

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；2.国家小麦改良中心贵州分中心，贵州 贵阳 550025)

小麦(Triticum aestivumL.)是世界范围内种植最广泛的粮食作物之一，其在不同生态条件下的适应性主要由开花和成熟时间决定[1]，并与含有的春化及光周期基因密切相关。春化和光周期基因又通过影响小麦的抽穗期和开花期表现出对环境条件的不同适应性，直接或间接影响小麦的品质和产量[2-5]。春化和光周期基因作为控制小麦生长发育的重要基因，与小麦对环境的适应性紧密相关，研究春化和光周期基因的组成对小麦育种、引种和推广具有重要意义[6]。

目前，春化和光周期基因的组成已基本明确。在小麦中，春化基因由Vrn1、Vrn2、Vrn3和Vrn4组成，其中Vrn1、Vrn2和Vrn3在通过春化作用诱导小麦开花的途径中起主要作用[7]。Vrn1在决定小麦冬春性中占主导地位，其基因座上存在3 个基因位点：VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1，分别位于小麦5A、5B 和5D 染色体长臂。其中，VRN-A1位点存在3 个能完全消除春化性状的显性变异位点Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c以及 1个隐性等位变异vrn-A1[8]，而VRN-B1和VRN-D1上的显性变异位点Vrn-B1和Vrn-D1只能导致部分春化性状消失。Vrn2是一种开花抑制因子，位于5A 染色体长臂，其表达水平经过春化作用后下调[9]，但当植物在春化过程中和春化后经历高温时，Vrn2的表达水平会被重新上调[10]。Vrn3与拟南芥光周期基因FT(flowering locusT)同源，其基因产物作为移动信号蛋白发挥作用，从叶片移动到茎尖分生组织，加速小麦开花[11]。目前，主要春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和VRN3的同源基因Vrn-B3的相关分子标记已被开发[11-13]，可用于小麦春化基因的鉴定。小麦光周期基因型主要由位于2D、2B 和2A 染色体上的Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1基因所决定，其中光周期不敏感型基因能减少小麦对光照的依赖，而Ppd-D1基因位点携带了最有效的光周期不敏感型等位基因Ppd-D1a，能加快小麦开花并加速小穗 发 育[14]。BEALES 等[15]和NISHIDA 等[16]开 发了Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1位点相关的分子标记，可用于检测小麦品种的光周期基因型。

近年来，不少学者针对小麦春化或光周期基因开展了相关研究。CHUMANOVA 等[2]研究了不同显性VRN等位基因及其组合对普通小麦生育期和产量的影响，发现Vrn-B1c 系的产量最高；KISS 等[17]对188 份冬小麦遗传多样性分析表明：小麦春化或光周期基因在不同类群中的基因频率存在差异，并引起抽穗期的差异。刘政等[18]研究表明：春化及光周期基因对光合及产量性状有一定影响，携带vrn-D1基因的品种具有高且稳定的光合能力及产量水平。游银等[19]对黄淮麦区部分骨干品种的春化和光周期特性进行了研究，并开展了相关基因等位类型分析及全基因组优异位点挖掘。朱雪成[20]利用春化基因及光周期基因的分子标记对选自江苏境内的114 份小麦品种(系)进行检测，研究了春化和光周期基因的分布情况。付亮等[21]分析了近年来河南省小麦新品种春化基因组成及其与品种的冬春性、苗穗期及产量性状的相关性。前人的这些研究进一步证实春化和光周期基因组成对小麦品种的适应性具有重要影响，但目前有关贵州小麦春化和光周期基因组成和分布的研究鲜有报道。贵州生态环境复杂，处于气候潮湿多雨的西南麦区，在小麦灌浆成熟期也经常会遇到延绵不断的阴雨天，影响小麦产量及品质[22-23]。因此，本研究利用小麦春化和光周期基因相关分子标记，对272 份小麦品种(系)的春化和光周期基因等位变异类型进行鉴定，并结合田间鉴定结果分析春化和光周期基因在田间自然条件下与小麦抽穗期和开花期的相关性，旨在了解春化和光周期基因的组成，探讨贵州小麦春化和光周期基因对抽穗期和开花期的效应，为贵州小麦生态适应性品种的选育和利用提供数据支持和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用贵州省内和部分省外共272 份小麦品种(系)作为供试材料，均由国家小麦改良中心贵州分中心选育，其中省内小麦材料142 份，省外小麦材料130 份(表1)。

表1 供试材料Tab.1 Tested materials

表1 (续)

表1 (续)

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 提取

每份材料随机取15 粒种子进行发芽，采用植物基因组DNA 提取试剂盒提取其DNA，利用分光光度计检测其含量，并稀释至50 ng/μL 备用。植物基因组DNA 提取试剂盒和2×TaqPCR Master Mix 反应试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker 购自生工生物工程(上海)股份有限公司；50×TAE 溶液购自北京酷来搏科技有限公司 。

1.2.2 分子标记检测

所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物详情见表2。以1.2.1 节提取的DNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 反应体系为10 μL，包括：10×PCR 缓冲液1.2 μL，25 μmol/L dNTPs 0.2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O 补足。

表2 引物信息Tab.2 Primers information

VRN-A1、VRN-B1、VRN-B3、VRN-D1、Ppd-A1和Ppd-D1位点PCR 反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，在不同退火温度(表1)下退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸5 min。Ppd-B1位点反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，70 ℃退火1 min(每循环降1 ℃)，72 ℃延伸1 min，10 个循环；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR反应时以ddH2O 代替模板DNA 作为空白对照，防止试验结果出现误差。PCR 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，80 V 电压电泳10 min，100 V 电压电泳40 min，使用凝胶成像系统进行拍照并统计带型。

1.2.3 田间抽穗期和开花期的观察鉴定

于2020 年11 月—2021 年6 月将供试材料种植于国家小麦改良中心贵州分中心试验地，不同品种分行种植，行长1 m，宽20 cm，以1 行中50%以上麦穗由叶鞘露出叶长的1/2 作为抽穗期标准，以1 行中50%以上麦穗中上部小花的内外颖张开和花药散粉作为开花期标准[24]，于田间观察并记录各品种的抽穗期和开花期。

1.2.4 数据分析

记录供试品种的基因型、抽穗期和开花期，利用SPSS 19 分析春化基因和光周期基因与抽穗期和开花期的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 分子标记检测结果

2.1.1 春化基因VRN-A1位点检测结果

利用3 对引物(VRNA1F 和VRNA1R、VRNA1F1 和VRNA1R1、VRNA1F2 和VRNA1R2)对所有供试材料检测发现：贵绿麦、Ciano、Banks和宁春13 等4 个品种在VRN-A1位点扩增出(965+876)bp 的条带，携带显性等位基因Vrn-A1a的占1.5%，其余贵麦1 号等268 份供试材料均扩增出734 bp 的条带，携带Vrn-A1c或vrn-A1显性等位基因。后续268 份供试材料均扩增出1 068 bp的条带，说明这些材料中均携带隐性等位基因vrn-A1。部分VRN-A1位点检测结果见图1。

图1 部分小麦品种VRN-A1 位点检测结果Fig.1 Detection results of VRN-A1 locus in some wheat varieties

2.1.2 春化VRN-B1位点鉴定

利用2 对引物(VRNB1F、VRNB1R 和VRNB1F1、VRNB1R1)分别对所有供试材料检测发现：贵紫麦1 号等145 份供试材料在VRN-B1位点扩增出709 bp 的条带，携带显性等位基因Vrn-B1的占53.3%；贵农775 等127 份供试材料扩增出1149 bp 的条带，携带隐性等位基因vrn-B1的占46.7%。部分VRN-B1位点检测结果见图2。

图2 部分小麦品种VRN-B1 位点检测结果Fig.2 Detection results of VRN-B1 locus in some wheat varieties

2.1.3 春化VRN-B3位点鉴定

利用2 对引物(VRNB3F、VRNB3R 和VRNB-3F1、VRNB3R1)分别对所有供试材料检测发现：所有供试材料在VRN-B3位点均扩增出1140 bp的条带，均携带隐性等位基因vrn-B3。部分VRNB3位点检测结果见图3。

图3 部分小麦品种VRN-B3 位点检测结果Fig.3 Detection results of VRN-B3 locus in some wheat varieties

2.1.4 春化VRN-D1位点鉴定

利用2 对引物(VRND1F、VRND1R 和VRND1F1、VRND1R1)分别对所有供试材料检测发现：贵州本地小麦等132 份供试材料在VRN-D1位点扩增出1 671 bp 的条带，携带显性等位基因Vrn-D1的占48.5%；中燕特大粒等140 份供试材料扩增出997 bp 的条带，携带隐性等位基因vrn-D1的占51.5%。部分VRN-D1位点检测结果见图4。

图4 部分小麦品种VRN-D1 位点检测结果Fig.4 Detection results of VRN-D1 locus in some wheat varieties

2.1.5 光周期Ppd-A1位点鉴定

利用2 对引物(PpdA1F、Ppd-A1R、Ppd-A1F和Ppd-A1R)分别对所有供试材料检测发现：所有供试材料在Ppd-A1位点均扩增出299 bp 的条带，均携带光敏感敏感型等位变异Ppd-D1b。部分Ppd-A1位点检测结果见图5。

图5 部分小麦品种Ppd-A1 位点检测结果Fig.5 Detection results of Ppd-A1 locus of some wheat varieties

2.1.6 光周期Ppd-B1位点鉴定

利用引物PpdB1F 和Ppd-B1R 对所有供试材料检测发现：所有供试材料在Ppd-B1位点均扩增出312 bp 的条带，均携带光敏感敏感型等位变异Ppd-B1b。部分Ppd-B1位点检测结果见图6。

图6 部分小麦品种Ppd-B1 位点检测结果Fig.6 Detection results of Ppd-B1 locus in some wheat varieties

2.1.7 光周期Ppd-D1位点鉴定

利用2 对引物(Ppd-D1F、Ppd-D1R 和Ppd-D1F、Ppd-D1R)分别对所有供试材料检测发现：川育38、毛颖阿夫和Gabo 等3 份供试材料在Ppd-D1位点扩增出414 bp 的条带，携带光敏感型等位变异Ppd-D1b的占1.1%；其余贵农18 等269 份供试材料扩增出288 bp 的条带，携带光不敏感型等位变异Ppd-D1a的占98.9%。部分Ppd-D1位点检测结果见图7。

图7 部分小麦品种Ppd-D1 位点检测结果Fig.7 Detection results of Ppd-D1 locus in some wheat varieties

2.2 春化和光周期基因分布频率分析

由表3 可知：在春化基因显性等位基因中，仅贵绿麦、Ciano、Banks 和宁春13 等4 份材料携带Vrn-A1a，其中贵绿麦为贵州小麦品种，Vrn-B1和Vrn-D1在贵州品种中的分布频率分别为85.2%和55.6%，均高于省外品种，没有检测到Vrn-B3；在光周期基因Ppd-D1位点，所有供试材料中仅Gabo、川育38 和毛颖阿夫等3 份材料检测出携带光敏感型基因Ppd-D1b，且均为省外品种，其余光周期基因位点均为Ppd-A1b+PpdB1b等位变异。

表3 春化和光周期等位基因分布频率Tab.3 Distribution frequency of vernalization and photoperiod allele

2.3 春化和光周期基因组成类型分析

由表4 可知：贵州省小麦品种存在5 种等位基因类型，其中vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a和vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a为主要的2 种类型，共占84.5%；省外品种选自不同地区，多为冬性和半冬性品种，存在8 种等位变异组合类型，其中vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a和vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a为主要的2 种类型，共占78.4%，其余组合类型均低于10%。

表4 春化和光周期等位基因组合Tab.4 Allele combinations of vernalization and photoperiod genes

2.4 春化和光周期基因与抽穗期和开花期的相关性

由表5 可知：272 份小麦品种(系)的抽穗天数和开花天数都有明显差异。

表5 省内外品种抽穗期和开花期比较Tab.5 Comparison of heading stage and flowering stage of varieties inside and outside the province

由表6 可知：Vrn-B1与抽穗期呈极显著负相关，与开花期无显著相关性；Vrn-D1显性等位基因与抽穗期和开花期呈极显著负相关；当材料中同时存在Vrn-B1和Vrn-D1等位基因时，与抽穗期和开花期呈极显著负相关，且它们之间存在加性效应。在本研究试验材料中，携带光敏感型等位变异Ppd-D1b的品种均同时携带了可以使抽穗期和开花期提前的Vrn-D1或Vrn-B1，但对供试材料Ppd-D1b与抽穗期和开花期的相关性分析结果表明：Ppd-D1b与抽穗期和开花期均呈极显著正相关。因此，可推测Ppd-D1位点对小麦抽穗期和开花期的影响程度可能高于Vrn-B1和Vrn-D1。

表6 春化与光周期基因位点相关性分析Tab.6 Correlation analysis between vernalization and photoperiodic gene loci

进一步分析结果显示：与全部携带隐性等位基因的小麦品种相比，携带单一显性等位基因Vrn-B1的小麦品种抽穗期和开花期分别提前1.6和0.7 d，携带单一显性等位基因Vrn-D1的小麦品种分别提前2.6 和2.7 d，同时携带Vrn-B1和Vrn-D1的小麦品种分别提前3.8 和4.0 d。

3 讨论

小麦属于长日照植物，不同小麦品种对光周期的响应差异较大，携带光周期不敏感型基因的品种在长或短日照下均能开花，具有较好的适应性[25]，更受小麦育种者的青睐。在本研究的所有材料中，效应最强的Ppd-D1位点由光周期不敏感型基因Ppd-D1a占主导地位，仅极少数材料携带光敏感型基因Ppd-D1b，Ppd-A1和Ppd-B1位点上则均携带Ppd-A1b和Ppd-B1b基因，这与韩领锋等[26]对西南麦区部分地区的小麦品种检测结果相近。ZHANG 等[27]检测了中国不同麦区的春化基因分布频率，检测到西南冬麦区中春化基因vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3的分布频率分别为15.2%、42.4%、78.8%和0。在本研究中，Vrn-B3基因的分布频率与ZHANG 等[27]的研究结果一致，均为0；而贵州小麦品种的其余春化显性等位基因中Vrn-B1的分布频率最高(85.2%)，其次是Vrn-D1(55.6%)和Vrn-A1a(0.7%)，与ZHANG 等[27]的研究结果存在部分差异，其原因可能与其供试材料中无贵州品种或与贵州独特的光温条件有关。

田芳慧等[28]研究发现：春化基因Vrn-B1、Vrn-D1和光周期基因Ppd-D1a与小麦抽穗期显著相关；朱雪成[20]则认为：Vrn-B1基因与小麦抽穗期并不存在显著相关性。本研究认为：Vrn-B1、Vrn-D1和Ppd-D1b与小麦抽穗期显著相关，Vrn-D1和Ppd-D1b与小麦开花期显著相关，且Vrn-B1和Vrn-D1间存在加性效应，并推测Ppd-D1b对于小麦抽穗期和开花期的影响程度高于Vrn-B1或Vrn-D1。但本研究中的开花期和抽穗期田间观察结果只有1 年，相关性分析结果的精确性还有待进一步验证。

贵州小麦在灌浆成熟期间经常遭遇阴雨天气，降水过多，产生渍害的同时还易引起病虫害，影响小麦的产量和品质[23]。合理的春化和光周期基因组合能让小麦避开极端天气，达到丰产和稳产的作用。目前，贵州小麦品种中含有春化和光周期等位基因类型和组合较省外品种少，其中，光周期等位基因组合仅有Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1a类型。

光周期不敏感型等位变异基因Ppd-A1a和Ppd-B1a以及春化显性等位基因Vrn-B3在中国出现的频率较低，且由于本研究中检测的省外小麦品种缺乏广泛性，故在供试材料中未检测到这些基因，此类基因构成的组合类型对小麦开花和抽穗期的效应关系尚未清楚。此外，在春化和光周期基因中还可能存在新的等位变异[29-31]，这些不同的等位变异类型影响小麦的生育周期，为育种工作者选育适合各地区的品种提供了更多可能性。因此，今后贵州的育种工作应多引进省外不同春化和光周期基因类型的小麦品种，为贵州各地区选育适合当地气候条件的小麦品种提供参考。

4 结论

贵州小麦中春化基因类型和组合较省外品种少，光周期基因组合类型仅有Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1a，种质资源有待进一步丰富。其中，春化显性基因Vrn-B1与小麦抽穗期显著相关，春化显性基因Vrn-D1和光周期敏感型基因Ppd-D1b与小麦抽穗期和开花期显著相关，可影响小麦的抽穗期和开花期。