益气温阳方对变应性鼻炎小鼠鼻黏膜线粒体动态变化及活性氧的影响

陈旭青，周龙云，马华安，刘书芬，吴继勇，严芮雯，严道南

1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029；3.上海中医药大学附属龙华医院，上海 210032

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）为耳鼻喉科临床常见病之一。一项全国11个城市随机抽样调查表明，2011年AR自报患病率平均为17.6%，较2005年患病率11.1%显著升高。研究显示，线粒体动态变化与AR等变应性疾病关系密切。线粒体过度分裂及下游活性氧（ROS）水平升高可介导多种变应性疾病。南京中医药大学附属医院严道南教授从事AR临床诊治及基础研究数十年，将AR病机归纳为“肺脾虚寒，清窍失煦不利，涕液统率失职”，提出AR“补肺益气，温阳散寒”治法，并据国医大师干祖望经验方加减创制益气温阳方，该方具有助益气阳、温肺散寒之功，临床疗效较好。前期研究显示，该方能有效缓解AR患者鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻塞等症状，抑制小鼠Th2型免疫应答，改善鼻黏膜局部炎症及损伤，但其具体作用机制尚不明确。线粒体作为细胞的能量中心，成为细胞内在“气、阳”的象征。本研究从线粒体动态平衡角度，探讨益气温阳方干预AR的潜在机制，为中医药治疗AR提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性C57BL/6小鼠40只，6周龄，体质量（20±2）g，上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物质量合格证号20180004040960，生产许可证号SCXK（沪）2018-0004。饲养于温度22～24 ℃、相对湿度50%～60%环境，光照时间12 h，自由摄食饮水，垫料每3 d更换1次。

1.2 药物及制备

益气温阳方（黄芪15 g，党参10 g，干姜9 g，桂枝10 g，麻黄6 g，五味子10 g，地龙10 g，乌梅10 g，甘草3 g），饮片购自南京中医药大学附属医院，加水常规煎煮，滤液浓缩至含原药材0.7 g/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。氯雷他定片，拜耳医药（上海）有限公司，10 mg/片，批号JS14813。取氯雷他定片研碎，加纯水配制成浓度为83.35 μg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

小鼠白细胞介素（IL）-4、IL-5、γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒（货号分别为70-EK204HS-96、70-EK205HS-96、70-EK280HS-96），杭州联科生物技术股份有限公司；ROS荧光探针试剂盒（货号E004-1-1），南京建成生物工程研究所；卵清蛋白（OVA，货号O1641），美国Sigam公司；氢氧化铝（货号C0151520323），南京化学试剂公司。体视显微镜（型号SZ51，日本Olympus公司），透射电子显微镜（型号Libra200，德国Carl Zeiss公司），多功能酶标仪（型号SpectraMax M5，美国Molecular Devices公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

40只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、益气温阳方组和氯雷他定组，每组10只。参考文献[11-12]制备AR小鼠模型，造模分为2个阶段：基础致敏阶段，除空白组外，其余各组小鼠分别于第0、7、14日腹腔注射致敏液300 μL（含25 μg OVA、1 mg氢氧化铝）致敏，空白组于相同时间点腹腔注射等体积生理盐水；攻击致敏在第21～27日连续进行，除空白组外，其余各组小鼠以20 μL/只OVA溶液（500 μg OVA溶于生理盐水）滴入双侧鼻腔，每侧10 μL，每日1次，空白组滴入等量生理盐水。造模第15～27日，益气温阳方组和氯雷他定组分别以14 g/kg、1.67 mg/kg相应药液灌胃，灌胃体积20 mL/kg（第21～27日于攻击致敏前1 h给药），空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，至第27日结束。

2.2 鼻过敏症状观察

造模第21、23、27日，于小鼠鼻腔攻击致敏后立即观察15 min，以盲法记录小鼠搔鼻、喷嚏情况。

2.3 血清细胞因子检测

实验第28日，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，眼底静脉丛取血，4 ℃、1 000×离心10 min，分离上层血清，ELISA检测血清IL-4、IL-5、IFN-γ含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.4 鼻黏膜病理形态观察及嗜酸性粒细胞计数

（＜0.01）；与模型组比较，益气温阳方组和氯雷他定组小鼠血清IL-4、IL-5含量明显减少，IFN-γ含量明显增加，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。益气温阳方组和氯雷他定组比较，差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表1。

表1 各组小鼠血清IL-4、IL-5、IFN-γ含量比较（±s，pg/mL）

颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠头部置于4%多聚甲醛中固定3 d，切取鼻尖至鼻根部10 mm组织，置于10%乙二胺四乙酸溶液中脱钙5 d，经20%、30%蔗糖溶液脱水，OCT胶包埋，切片（7 μm），HE染色观察小鼠鼻黏膜组织病理变化并计算高倍视野下（400倍）嗜酸性粒细胞数目。

2.5 活性氧检测

颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剥离鼻黏膜并剪碎，加入预冷PBS研磨，制成组织匀浆，4 ℃、1 000×离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，取95 μL上清液加至96孔板，加入2 mmol/L DCFH-DA溶液5 μL，37 ℃避光孵育30 min，以激发波长480 nm测定样品荧光强度，计算ROS含量。

2.6 线粒体超微结构观察

取固定后的小鼠头部，小心剥离鼻中隔黏膜，经2.5%戊二醛固定、2%锇酸固定、PBS漂洗、梯度乙醇脱水、树脂包埋，超薄切片机制备70 nm厚组织切片，醋酸双氧铀及柠檬酸染色后，将样品置于透射电镜下观察小鼠鼻黏膜超微结构。

3 统计学方法

4 结果

4.1 益气温阳方对模型小鼠鼻过敏症状的影响

造模第21、23、27日，与空白组比较，模型组小鼠搔鼻、喷嚏次数明显增加（＜0.01）；造模第23、27日，与模型组比较，益气温阳方组和氯雷他定组小鼠搔鼻、喷嚏次数明显减少（＜0.01）。见图1。

图1 各组小鼠搔鼻、喷嚏次数比较（±s，每组10只）

4.2 益气温阳方对模型小鼠血清白细胞介素-4、白细胞介素-5、干扰素-γ含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清IL-4、IL-5含量明显增加，IFN-γ含量明显减少，差异有统计学意义

4.3 益气温阳方对模型小鼠鼻黏膜病理形态的影响

HE染色显示，空白组小鼠鼻黏膜结构完整，黏膜下未见明显嗜酸性粒细胞浸润，间质无明显增生、水肿；模型组小鼠鼻黏膜上皮破坏明显，纤毛紊乱，黏膜下可见大量嗜酸性粒细胞浸润，数量较空白组明显增加（＜0.01），间质出现增生及水肿；益气温阳方组和氯雷他定组小鼠鼻黏膜上皮损伤及纤毛紊乱程度减轻，黏膜下嗜酸性粒细胞数量较模型组明显减少（＜0.01），间质增生及水肿有一定改善。见图2、图3。

图2 各组小鼠鼻黏膜组织形态（HE染色，×400）

图3 各组小鼠鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞数目比较（±s，每组4只）

4.4 益气温阳方对模型小鼠鼻黏膜组织活性氧水平的影响

与空白组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织ROS水平明显升高（＜0.01）；与模型组比较，益气温阳方组和氯雷他定组小鼠鼻黏膜组织ROS水平明显降低（＜0.05，＜0.01）。结果见表2。

表2 各组小鼠鼻黏膜组织ROS水平比较（±s，105 U/mg）

4.5 益气温阳方对模型小鼠鼻黏膜组织线粒体形态的影响

透射电镜观察显示，空白组小鼠鼻黏膜组织可见长管状线粒体广泛分布，椭圆状线粒体并存，线粒体嵴与双层膜结构清晰，周围可见高尔基体、内质网等环绕；模型组小鼠鼻黏膜组织线粒体多呈圆球状，线粒体嵴和双层膜结构模糊，线粒体长度较空白组明显缩短，差异有统计学意义（＜0.01）；益气温阳方组和氯雷他定组小鼠鼻黏膜组织线粒体形态有所恢复，线粒体长度较模型组明显增加，差异有统计学意义（＜0.05）。见图4、表3。

图4 各组小鼠鼻黏膜组织超微结构（透射电镜，×15 000）

表3 各组小鼠鼻黏膜组织线粒体长度比较（±s，μm）

5 讨论

益气温阳方以黄芪、党参为君，伍以干姜、桂枝、地龙、乌梅诸品，共奏补肺益脾、温阳散寒之功。该方对AR临床症状及局部变应性炎症具有良好作用。本研究显示，造模第21日，AR小鼠即表现出一定的搔鼻、喷嚏现象，其次数随致敏时间延长逐渐增加；益气温阳方组小鼠造模第23、27日搔鼻、喷嚏次数均明显低于模型组，且随着致敏时间延长，益气温阳方组小鼠搔鼻、喷嚏次数趋于平稳，与氯雷他定组比较无明显差异，提示益气温阳方能在持续过敏原刺激下稳定模型小鼠鼻腔过敏症状。HE染色发现，OVA致敏后，模型组小鼠鼻黏膜较空白组显著增厚，黏膜纤毛倒伏，黏膜下层存在大量嗜酸性粒细胞浸润，血管扩张，腺体排列紊乱。益气温阳方干预能显著减少黏膜下层嗜酸性粒细胞浸润，减轻血管、腺体结构改变，一定程度上缓解免疫细胞浸润所致黏膜增厚现象。另外，ELISA结果显示，益气温阳方能有效逆转OVA所致小鼠血清Th2型细胞因子IL-4、IL-5水平升高及Th1型细胞因子IFN-γ水平降低。上述结果进一步证实益气温阳方良好的抗过敏作用。

线粒体是细胞呼吸和代谢的能量中心。研究表明，线粒体功能紊乱及形态异常变化为T细胞异常活化、肥大细胞脱颗粒、B细胞IgE分泌等活动的重要内在因素。本研究结果显示，空白组小鼠鼻黏膜长管状线粒体广泛分布，并见散在分布的椭圆状线粒体；模型组小鼠鼻黏膜可见大量圆球状线粒体分布，线粒体脊、双层膜结构较为模糊；益气温阳方组和氯雷他定组小鼠线粒体形态有所恢复，线粒体长度较模型组显著增加，线粒体结构紊乱得到改善。线粒体过度分裂导致呼吸链受损，氧自由基代谢途径破坏，进而诱发线粒体释放大量ROS。ROS能通过激活变应性炎症相关信号分子介导炎症因子的大量释放，加剧局部炎症反应。DCFH-DA染色显示，模型组小鼠鼻黏膜组织ROS水平较空白组显著升高，益气温阳方干预可降低ROS水平，其作用与氯雷他定相当。上述结果表明，益气温阳方干预AR的作用可能与调节线粒体动态变化及ROS内生相关。

本研究尚存在一定不足：①AR制备模型方案较多，各模型具备自身优势，但均与AR患者的临床表现及病理变化存在一定差异。本研究未能采取多种模型揭示益气温阳方效应及机理，所获结论可能与该方的临床效果存在偏差。②超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢酶是氧化应激损伤相关的重要指标，受样本量影响，本研究未对其进行全面检测。基于益气温阳方潜在的抗氧化应激作用，今后将继续深入探索其干预AR的具体作用机制，进一步筛选益气温阳方潜在有效成分，以更好地精简、把控处方，确保其临床疗效。

综上，线粒体动态失衡为变应性疾病发展的重要因素，调控线粒体动态变化可能是AR治疗的新方向。益气温阳方能有效改善AR小鼠过敏症状及变应性炎症反应，该效应可能与抑制线粒体过度分裂及下游ROS大量释放相关。