海拔高度变化对牦牛血细胞生理指标及心、肺组织形态特征的影响

李 潇，高彦华,2，彭忠利,2，郭春华,2，王 琦，梁 红，王 丹

(1.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041)

牦牛是高原畜牧业的主要畜种，然而川西高原地区天然草场生态脆弱，饲草供应不足，传统的放牧养殖模式无法满足牦牛的营养需求。牧民受传统思想的影响，往往通过自然淘汰出栏，使得牦牛出栏时间长，养殖效率低，并且增加草地放牧强度，导致草畜矛盾凸显，加剧草原生态破坏，严重制约川西高原畜牧业的发展。利用草原放牧繁育架子牛，后期集约化圈养育肥是提高牦牛养殖生产效率的重要方式。川西高原牧区交通不便，饲料运输成本高昂，山地多不利于建设大型集约化养殖场，而临近的成都平原能提供较好的集约化养殖条件和场地。杨勤等报道表明牦牛能够适应成都平原低海拔环境进行异地舍饲育肥，但尚不清楚牦牛适应低海拔地区的敏感指标以及机制。因此，本研究在探讨牦牛从高海拔向低海拔地区迁移后血液生理指标和血清皮质醇浓度变化规律的基础上，比较海拔高度变化对牦牛心脏及肺脏组织形态的影响，旨在确定牦牛对低海拔环境适应的敏感指标，并从组织形态学角度初步揭示牦牛适应低海拔环境的机制，为合理指导牦牛异地迁移饲养提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择及试验设计

随机选择来自高海拔地区(四川省阿坝州壤塘县，平均海拔3 500 m)放牧饲养的6头麦洼公牦牛，年龄3～5岁，平均体重200±30 kg。另外在成都青白江肉牛屠宰场随机选择6头麦洼公牦牛(来自四川省阿坝州牧区，平均海拔3 500 m，体重年龄与试验牦牛相近)和6头西门塔尔与川南黄牛的杂交公黄牛(来自四川省成都平原，平均海拔500 m，年龄与试验牦牛相近)作为比较屠宰试验动物。

于第0天(试验开始当天，在高海拔地区)、第2天(d2，转场至低海拔地区第1天)、5、8、16、31天牦牛空腹过夜后颈静脉采血，保存在肝素钠抗凝管内，测定血细胞生理指标；另取一份全血样品，3 000 g离心10 min，分离血清，分装至2 mL无菌冻存管中液氮速冻，-80 ℃保存。在饲养期结束后，对低海拔试验牦牛、高海拔牦牛及低海拔黄牛进行屠宰，采集左心室下缘心肌组织和左侧肺脏下缘组织样本，置于4%多聚甲醛溶液内进行固定，后续用于制作石蜡切片。

1.2 试验动物饲养管理

将试验动物运输转移到低海拔地区(四川省长宁县，平均海拔500 m)进行舍饲养殖，草料组成与养分含量见表1，饲养期共64 d。

表1 试验牦牛的草料组成和养分含量(干物质基础)

1.3 测定指标

1.3.1 血细胞生理指标 采集的牦牛全血样本送至成都里来生物科技公司，利用全自动血细胞分析仪(江西特康TEK-II MINI系列)测定红细胞数量(RBC)、红细胞比积(HCT)、血红蛋白含量(HGB)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板数(PLT)、血小板比积(PCT)、白细胞数量(WBC)、淋巴细胞数量(LYC)、中间细胞数量(MC)、粒细胞数量(GRC)等血细胞生理指标。

1.3.2 血清皮质醇浓度 牦牛血清样品用生理盐水稀释125倍，采用牛皮质醇ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，通过竞争性抑制酶联免疫吸附试验测定皮质醇的含量；同时采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，通过微孔板比色法测定牦牛血清样本中总蛋白的含量，计算得到血清皮质醇的相对浓度(血清中总蛋白含量/血清皮质醇含量)。

1.3.3 心肌纤维直径、数量和肺泡隔厚度 心脏和肺脏组织经4%多聚甲醛固定过夜后，经脱水(常州中威TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机)、石蜡包埋(常州中威BMJ-Ⅲ型包埋机)、切片(德国徕卡-2016转轮式切片机)，苏木精-伊红染色，利用显微镜(徕卡DM3000)对切片进行图像采集，Image-Pro Plus 6.0图像处理软件测定心肌纤维直径、心肌纤维数量和肺泡隔厚度，每张切片记录3个不同视野计算平均值。

1.3.4 肺泡平均截距 采用STEPanizer软件进行肺泡平均截距的测量与计算，其计算公式为：

其中：.肺泡平均截距(Mean linear intercept，又称Chord length)，单位为μm；.测量体系中使用的参考测量线的长度，STEPanizer软件在设置好测量体系后直接给出此参数，表示为L(P)，单位为μm；()测量体系中落在肺泡气体区域内的参考测量线端点(即指示肺泡腔空白区域的端点)的数量，记录原则为记上不记下，记右不记左；().测量体系中参考测量线与肺泡间隔组织交叉点的数量。

1.4 数据处理

牦牛血液生理指标数据采用SPSS 24.0进行重复测量数据单因素方差分析，利用一般线性模型GLM对数据进行球形检验，多重比较选择Ducan法检验，<0.05表示差异显著。牦牛心脏和肺脏组织形态数据采用Graphpad Prism 6.0进行统计分析和绘图。两组之间的差异采用检验，<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 牦牛血细胞生理指标

从高海拔地区向低海拔地区迁移后，牦牛血细胞生理指标随时间变化情况见表2。红细胞指标方面，随着海拔高度降低，RBC呈现随时间变化线性降低的趋势但差异不显著(>0.05)，HCT、HGB显著线性降低(<0.05)，转移至低海拔的第16和31天HCT、HGB显著低于转移前(第0天，<0.05)。MCH、MCHC极显著线性降低(<0.01)，其中第31天时MCH显著低于第0天(<0.05)，从第5天开始MCHC均显著低于第0天(<0.05)。PLT、PCT未观察到显著变化。白细胞指标方面，海拔高度降低后，WBC、LYC和GRC随时间发生显著性改变(<0.05)，其中WBC呈现显著先增加后降低二次变化规律(<0.05)，LYC也呈现显著二次变化规律(<0.05)，而GRC未呈现显著变化规律，MC无变化。

表2 牦牛的血细胞生理指标测定结果

2.2 牦牛血清皮质醇浓度

牦牛从高海拔地区向低海拔地区迁移后，血清皮质醇水平随时间变化情况见图1。结果表明，随着海拔高度的降低，皮质醇浓度随时间延长极显著升高(<0.01)。从转移到低海拔的第5天起，牦牛血清皮质醇浓度显著高于迁移前(第0天)(<0.05)。

图1 牦牛的血清皮质醇浓度

2.3 牦牛心肺形态学检查结果

2.3.1 牦牛心脏组织形态检查结果 牦牛迁移至低海拔地区饲养后，牦牛心肌纤维形态学变化情况见图2和图3。与高海拔放牧牦牛和低海拔舍饲黄牛相比，低海拔试验牦牛心肌纤维直径无明显改变(图3A)；低海拔试验牦牛心肌纤维密度在低海拔富氧环境下发生了代偿性的降低，显著低于高海拔放牧牦牛(<0.05，图3B)，但与低海拔舍饲黄牛之间差异不显著。

图2 牦牛心脏组织切片图(400×)

图3 牦牛心脏组织形态比较

2.3.2 牦牛肺组织形态检查结果 牦牛迁移至低海拔地区饲养后，肺组织形态学变化情况见图4。与高海拔放牧牦牛相比，低海拔试验牦牛肺泡间隔厚度极显著降低(<0.001，图5A)，但与低海拔黄牛之间差异不显著(>0.05)。低海拔试验牦牛与高海拔放牧牦牛的肺泡数量无差异，但二者仍都显著高于低海拔舍饲黄牛(<0.05，图5B)。低海拔试验牦牛平均肺泡截距显著高于高海拔放牧牦牛(<0.05，图5C)，但与低海拔舍饲黄牛相比无差异。

图4 牦牛肺组织切片图(400×)

图5 牦牛肺脏组织形态比较

3 讨 论

牦牛()主产于中国青藏高原海拔3 000 m以上地区，是高海拔地区的特有牛种，具有耐高寒缺氧、耐粗饲的特点，是青藏高原牧区重要的畜种资源。传统放牧模式下牦牛出栏时间长，生产效率低下，并容易造成草场过度载畜，对高原生态环境也造成了不利的影响。将牦牛由高海拔地区转移至低海拔地区舍饲育肥能显著增加牦牛养殖效益，缓解高原草场生态压力，并已有相应的研究及实践。然而从高海拔向低海拔的异地迁移过程中，牦牛也面临如长途运输、温度改变、氧分压变化等诸多应激情况，但相应的适应机制及敏感指标尚不清楚。

3.1 高海拔向低海拔迁移对牦牛血液生理指标的影响

牦牛世代生活在高海拔低氧条件下，需要保证组织细胞的氧气供应，因此血液生理指标变化往往能够直观地反映出牦牛对于海拔高度变化的适应情况，其中红细胞和血红蛋白含量主要反映动物机体的携氧能力。海拔高度越高，氧分压越低，当动物血液含氧量降低时，可促使RBC、HCT、HGB等含量代偿性增加，以满足机体对氧的需求。生活在不同海拔高度地区牦牛的RBC、HCT、HGB等含量存在显著差异，在较高海拔高度地区的牦牛具有更高的RBC、HCT、HGB等含量，表明RBC和HGB与海拔高度呈显著正相关。本试验中，牦牛从高海拔迁移到低海拔地区，随着时间延长，红细胞参数RBC、HCT以及血红蛋白参数HGB、MCH、MCHC均出现显著下降的变化规律，并且低海拔地区适应31 d时，牦牛血液中HCT、HGB、MCH、MCHC含量显著低于高海拔地区，此结果与江家椿等、刘凤云等研究结果一致，提示牦牛在转至低海拔地区饲养后，随着氧分压上升，通过降低血液中红细胞及血红蛋白含量的机制，逐渐适应低海拔富氧环境。血小板指标是评价血液凝血能力和血液流通能力的重要参数，其中，PLT是主要反映血小板生成与衰亡的指标，PCT主要反映血小板总容积。高海拔缺氧状态能引起人的血小板被大量激活和消耗，使循环血中PLT减少，导致骨髓巨核细胞代偿性增加，产生更大体积的血小板，其间伴随着PCT的减小。因此，血小板参数可能与海拔高度变化呈现负相关。然而本试验中没有观测到牦牛血液中PLT和PCT发生显著变化，该结果与唐可人等对不同海拔高度饲养的淮北麻鸡PLT和PCT结果一致。这可能是由于血小板指标受物种、品种、饲养环境、应激等因素的影响，关于海拔高度与牦牛血小板含量的关系有待进一步研究予以揭示。白细胞是血液中主要免疫细胞的总称，主要包括单核细胞、粒细胞和淋巴细胞，白细胞指标的变化能初步反映动物免疫应答的能力。本试验观察到牦牛从高海拔地区向低海拔地区迁移后，白细胞指标总体上呈现随时间先增加后降低的显著性变化规律。特别是在迁移至低海拔的第一周，外周WBC、LYC、GRC随时间延长显著增加，其中WBC、LYC在迁移后第5天达到峰值，而GRC在第2天达到峰值，这可能是由于粒细胞主要发挥非特异性免疫的作用，应答速度较快，而淋巴细胞主要发挥特异性免疫应答，应答速度较慢。刘培培等报道了环境因素的改变，如早期断奶应激，能促进牦牛外周血WBC增加；在藏猪异地迁移饲养的报道中也观察到迁移后血液WBC增加的情况，均与本试验的结果类似，可能是由于牦牛在迁移的过程中由于运输、环境改变等因素导致的应激反应所致。在迁移一周以后(第8天)，牦牛血液白细胞指标就能恢复至转移前的水平，表明牦牛逐渐适应低海拔环境，应激反应减轻并恢复正常状态。上述研究结果提示外周血白细胞水平能作为异地迁移过程中，反映牦牛应对环境变化的敏感指标。

3.2 高海拔向低海拔迁移对牦牛血清皮质醇浓度的影响

皮质醇是肾上腺皮质分泌的糖皮质激素，受下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴调控释放，作用是提高机体对应激情况的适应力与抵抗能力，增加白细胞溶酶体膜稳定性，减少热敏蛋白释放，缓解炎症，皮质醇水平变化能反映出动物对免疫应激反应程度及适应情况。在本试验中，牦牛迁移至低海拔地区后，由于运输过程及海拔高度的变化，血清皮质醇浓度呈现显著线性增加的变化规律，表明异地迁移使牦牛发生了较强的应激反应，与血液白细胞指标在转移初期的变化规律相符，提示血清皮质醇含量也是应对环境变化的敏感指标，该结果也与杨磊等报道的人群在高原短期暴露后返回低海拔地区适应期血清皮质醇水平的变化结果类似，高原短期暴露人群返回平原初期皮质醇水平显著上升，之后下降恢复正常水平。然而本试验并未观察到牦牛血清皮质醇浓度下降的拐点，可能是由于迁饲牦牛仍处于应激期，还需检测其他指标予以佐证。也有报道表明高海拔地区人群血清皮质醇水平显著低于低海拔地区人群，因此低海拔牦牛血清皮质醇含量上升可能是其对低海拔环境适应，但海拔高度对血清皮质醇含量的影响机制还需进一步研究予以揭示。

3.3 高海拔向低海拔迁移对牦牛心肺形态学的影响

动物机体长期对低氧环境适应会引起其心脏在组织学和酶化学水平的改变，以维持正常生理功能，例如低氧会增加动物的肌肉组织中微血管密度，以提高肌肉的摄氧效率，增强动物对低氧环境的适应能力，因此，本试验从心脏组织形态学角度，分析探讨了牦牛对海拔高度变化的适应机制。对心肌纤维直径和密度的分析结果表明，牦牛心肌纤维直径和密度存在品种差异，与张勤文等报道发现大通牦牛的心肌纤维直径与密度均高于乐都牦牛的结果一致。随着海拔高度的降低，牦牛心肌纤维密度也显著降低，提示经过一段时间适应低海拔富氧环境以后，牦牛可代偿性的减少心肌纤维数量，与张勤文等发现高海拔地区大通牦牛心肌纤维表面积密度高于低海拔地区大通牦牛的结果相一致，提示心肌纤维密度于环境氧分压存在负相关，在低氧环境中的动物可能通过代偿性增加心肌纤维数量，增强心脏泵血功能与氧气的供应，从而维持低氧情况机体对氧气代谢的需求。

牦牛适应环境氧气含量变化的机制还能通过肺组织形态学的变化反映。肺泡隔厚度和肺泡密度是反映动物肺脏对空气交换能力的指标，平均肺泡截距是一种可定量评价肺气体交换功能的形态学表观指标。本试验发现高海拔放牧牦牛肺泡隔厚度极显著的高于低海拔试验牦牛和低海拔黄牛，并且低海拔试验牦牛与黄牛相比无差异，与张勤文报道的海拔高度对牦牛肺泡隔厚度影响结果和魏青等报道的高原牦牛肺泡隔厚度大于黄牛的结果相一致，表明肺泡隔厚度变薄是牦牛适应低海拔环境的特征，并且与品种无关。海拔高度影响肺泡隔厚度的可能原因是由于肺泡隔内含有较多的毛细血管和弹性纤维，且随着环境氧分压变化, 肺泡隔中细小动脉中平滑肌含量代偿性增加或减少，从而使动物适应海拔高度变化。此外，高海拔牦牛肺泡隔厚度增加可能还与肺泡壁中毛细血管扩张、红细胞较多有关, 这种变化可以使肺气体交换过程中氧气的吸入增多和二氧化碳的排出加快，气体交换效率提高，能够更好地适应高海拔低氧的环境。本试验还发现海拔高度变化对牦牛肺泡数量无影响，这与魏青等报道对高原牦牛和平原牦牛肺泡组织结构的比较结果一致。牦牛出生在高原，初生时期肺泡发育较平原黄牛完善，并且能够以“芽生”的形式快速增加，单位面积内肺泡数量的增多，有利于增大肺的呼吸面积，提高肺组织对氧气的利用率，从而促进高原牦牛适应高原低氧环境，并且牦牛肺泡发育到一定阶段之后的结构能保持相对稳定，这可能是低海拔试验牦牛肺泡数量与高海拔牦牛相比无差异的原因。此外，肺泡数量存在品种差异，牦牛的肺泡数量显著高于黄牛，这与贾荣莉、俞红贤报道的藏羊肺组织单位面积内肺泡数多于小尾寒羊、孙宏夫等报道高原犬单位面积肺泡数多于平原犬的结果类似，提示肺泡数量是动物对气候环境长期适应发生基因水平改变并能稳定遗传与表现。本试验还发现低海拔试验牦牛平均肺泡截距显著高于高海拔放牧牦牛，但与低海拔舍饲黄牛相比无差异。平均肺泡截距衡量了呼吸道内发生气体交换的空间大小，低海拔试验牦牛肺泡截距显著增加，表明海拔降低后，随着空气氧分压的上升和肺泡隔的变薄，牦牛呼吸道内参与气体交换的空间增大，也是牦牛逐渐适应低海拔环境的表现。

4 结 论

牦牛从高海拔迁移至低海拔地区降低了血液红细胞生理指标HCT、HGB、MCH和MCHC的含量，在迁移后1周内 WBC、LYC、GRC先升高后降低，血清皮质醇含量升高，并在一段时间后通过降低心肌纤维密度和肺泡间隔厚度以及提升平均肺泡截距，适应低海拔富氧环境。研究结果为合理指导牦牛的异地迁移至低海拔地区饲养提供了数据支持和理论依据。