产木聚糖酶微生物的筛选鉴定及特性分析

赵龙妹，张迎燕，李 旺，李元晓，曹平华，何万领

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023)

木聚糖是自然界中含量最高的半纤维素，是由以β-1,4-糖苷键连接的吡喃木糖残基构成的骨架组成的复杂多聚物。根据植物种类的不同，木聚糖的含量和结构组成差异较大。中国纤维类农业副产品种类多、数量大，其中玉米芯木聚糖含量较高，约为35%～40%。中国畜牧业面临着饲料资源短缺的问题，若能有效利用微生物和酶对农业副产物中难以被消化吸收的物质进行降解，就可以实现农业副产品高值化、营养化，缓解饲料资源紧张的现状。纤维类农业副产物中主要包括大量纤维素、木聚糖等半纤维素以及少量的木质素、果胶，其中木聚糖包裹着纤维素，阻碍纤维素的酶解，因此，降解木质纤维类物质的关键是解除阻碍，增加酶与纤维素接触的机会。木聚糖经酶解后可生成低聚木糖，这种益生元还能够维护动物胃肠道微生态平衡。

对多纤维物质的降解有两个途径：一是利用水解酶进行直接降解；另一个是利用产酶微生物进行生物发酵降解；后者降解更充分，因此需要筛选获得高效产酶微生物。而决定筛菌是否成功的关键在于样品的选择和筛选方案的设计。不同的样品特征决定其中所含微生物的种类，不同的筛选方案和样品处理方法会导致所获得的目的菌株的差异。因此，本研究选择不同样品(土壤、山羊瘤胃内容物、山羊肠道内容物和山羊粪便)，以自制木聚糖为唯一底物从中筛选产木聚糖酶微生物并对其进行鉴定和特性分析。

1 材料与方法

1.1 试验样品

取放牧山羊草地表层土壤及10 cm深处土壤混合物，4 ℃保存并立即进行样品处理。选取体重55 kg的1.5岁雌性波尔山羊进行解剖，分别取瘤胃内容物20 mL、肠道后段内容物适量和山羊新鲜粪便适量置于灭菌离心管中，4 ℃保存并立即进行样品处理。

1.2 主要仪器设备

立式高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，双人单面超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司)，电子精密天平(JA2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，恒温摇床(SKY-2112B，上海苏坤实业有限公司)，恒温培养箱(DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司)，高速台式离心机(TGL-16B，上海安亭科学仪器厂)，酶标仪(ReadMax 1000F，上海闪谱生物科技有限公司)，生物显微镜(CX31，购于奥林巴斯有限公司)。

1.3 主要试剂和培养基

自制木聚糖：利用碱法提取玉米芯中的木聚糖；胰蛋白胨和酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；硝酸钠、磷酸氢二钾等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)试剂：参照文献[7-8]配制；初筛固体培养基：自制木聚糖10 g，NaNO2.0 g，KHPO1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，FeSO0.01 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL；复筛固体培养基：KHPO1.31 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，NaNO2 g，FeSO0.002 g，自制木聚糖 5 g，胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL；液体发酵培养基：KHPO1.31 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，NaNO2 g，FeSO0.002 g，自制木聚糖 5 g，胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸馏水 1 000 mL；产蛋白酶筛选固体培养基：蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸氢二钾4.0 g，琼脂20.0 g，脱脂奶粉 2 g，蒸馏水 1 000 mL；121 ℃，0.11 MPa灭菌25 min，制备固体平板培养基或直接冷却备用。

1.4 产木聚糖酶微生物的筛选

1.4.1 初筛 分别取1 g样品置于50 mL离心管中，加入9 mL 无菌生理盐水，置于摇床中振荡均匀，使用灭菌生理盐水进行梯度稀释，将适当稀释的样品均匀涂布于初筛固体培养基上，将平板倒置于30 ℃条件下培养24～48 h，直至菌落长出。

1.4.2 复筛 将初筛固体培养基上长势良好的单菌落接种于复筛固体培养基上，30 ℃培养24～48 h，菌落长出后先用1 mg/mL 刚果红染色3 h，然后用1 mol/L NaCl溶液进行脱色，根据透明圈和菌落的大小筛选具有较强木聚糖降解能力的菌株。筛选出的菌株30 ℃ 200 r/min条件下培养24～48 h，取菌液12 000 r/min离心5 min，使用DNS法测定发酵上清液中的木聚糖酶活力，根据木聚糖酶活力大小确定目的菌株。

1.5 产木聚糖酶微生物的鉴定

1.5.1 形态学鉴定 挑取单菌落接种于复筛固体培养基中，30 ℃培养24～48 h，观察平板上长出单菌落的形态特征，并对其进行革兰染色镜检，观察菌体特征，根据伯杰细菌手册对其进行鉴定。

1.5.2 分子生物学鉴定及遗传多样性分析 挑取单菌落接种于液体发酵培养基中，30 ℃ 200 r/min条件下培养18～24 h，提取基因组，使用16S rDNA通用引物(27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增获取16S rDNA片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将获得的序列信息在NCBI网站上进行比对分析，并通过GenBank下载相似性高的序列，使用MEGA X软件通过NJ法构建系统发育树，分析产木聚糖酶微生物之间以及与其他菌株的遗传学关系。

1.6 木聚糖酶酶学特性分析

1.6.1 木聚糖酶活力测定 取适量菌液，12 000 r/min离心5 min，上清即为粗酶液。木聚糖酶活力测定方法参考《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法》，使用DNS法进行测定。木聚糖酶活力定义：在一定温度和pH条件下，每分钟水解1%自制木聚糖产生1 μmol还原糖(木糖)对应的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.6.2 最适反应温度 在一定pH条件下，将适当稀释的粗酶液与1%自制木聚糖底物溶液分别于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃条件下反应，测定木聚糖酶活力大小，确定最适反应温度。

1.6.3 最适反应pH 配制pH为3.0～7.0的0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和pH为8.0～10.0的0.2 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，在一定温度条件下，分别测定粗酶液于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下的木聚糖酶活力大小，确定最适反应pH。

2 结果与分析

2.1 产木聚糖酶微生物的筛选与鉴定

2.1.1 菌株筛选 经过初筛，从土壤、山羊肠道内容物、瘤胃内容物和粪便中共筛选到9个株菌，分别接种于复筛固体培养基上，经刚果红染色和NaCl脱色后，其透明圈如图1所示。木聚糖酶活力测定结果见表1。选取酶活力最高的3株菌YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1进行后续试验分析。

表1 筛选菌株的透明圈、菌落直径和酶活

图1 9株菌在平板上的透明圈

2.1.2 菌株形态学鉴定 YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1在30 ℃培养24 h，其菌落形态和镜检结果如图2A和图3所示。菌株YF-2-1在平板上的菌落近圆形，暗白色，不透明，表面干燥呈褶皱状，褶皱菌膜内呈粘液状，经革兰染色镜检发现该菌为革兰阳性菌，多为单杆菌，少数菌体内可见芽孢；菌株YL3-2-1在平板上的菌落为圆形或不规则形，色暗，呈奶油色，表面湿润，经革兰染色后镜检可观察到其为革兰阳性菌，呈杆状，少数菌体内可见芽孢；菌株T2-2-1在平板上菌落呈圆形，暗白色，表面变厚，无褶皱，经革兰染色镜检发现其为革兰阳性菌，多为单杆菌，极少数双杆菌，个别菌体内可见芽孢。查阅《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》，初步鉴定3株菌均为芽孢杆菌。此外，使用产蛋白酶筛选固体培养基进行培养，发现3株菌均具有蛋白酶活性，其中YF-2-1与T2-2-1较明显(图2B)。

图2 3株菌的菌落形态以及产蛋白酶透明圈

图3 3株菌的镜检图

2.1.3 菌株分子生物学鉴定 将测序获取的16S rDNA序列在NCBI网站上进行BLAST，并通过MEGA X使用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，发现菌株YL3-2-1与高地芽孢杆菌()同源性最高，相似性为99.86%、菌株YF-2-1与贝莱斯芽孢杆菌()同源性最高，相似性为99.93%，菌株T2-2-1与贝莱斯芽孢杆菌()同源性最高，相似性为100%，故将菌株YL3-2-1鉴定为高地芽孢杆菌()、将菌株YF-2-1和T2-2-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌()。

2.2 序列分析

将分离获得的3株芽孢杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株序列进行同源性分析，构建系统发育树，并分析3株菌及其与其他相关菌株之间的亲缘关系，结果见图4。

YL3-2-1菌株与6株相关菌株聚类后分为2个主要分支，其中较大分支又由2个小分支组成，在其中1个小分支中可见菌株YL3-2-1与MN511801.1聚为一支(图4A)。

图4 3株产木聚糖酶芽孢杆菌与Genbank相关菌株的16S rDNA序列系统发育树

YF-2-1菌株与4株相关菌株聚类后分为2支，其中较大分支又分为2个小分支，在其中1个小分支中可见菌株YF-2-1与MK070084.1聚为一支(图4B)。

T2-2-1菌株与4株相关菌株聚类后分为2支，其中较小分支中可见菌株T2-2-1与MF620083.1聚为一支(图4C)。

本试验获得的3株菌与Genbank数据库收录的5株相关菌株聚类后分为2个主要分支，每个主要分支又由2个小分支组成，其中一个主要分支中可见T2-2-1与MF620083.1聚为1支后，又与YL3-2-1聚为1支，另一个主要分支中可见YF-2-1与MK070084.1聚为1支，YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1有一定的亲缘关系(图4D)。

2.3 木聚糖酶酶学特性分析

试验获得的3个菌株所产木聚糖酶测定结果见图5。YL3-2-1所产木聚糖酶最适反应pH为7.0，在pH 6.0～8.0之间能够发挥70%以上的酶活；最适反应温度为60 ℃，且在70 ℃条件下能够发挥90 %以上的酶活，在30～70 ℃之间能够发挥70 %以上的酶活，此木聚糖酶为中性木聚糖酶。

图5 3株菌所产木聚糖酶最适反应条件

YF-2-1所产木聚糖酶最适反应pH为5.0，当pH下降时，酶活急剧下降，在pH 5.0～8.0之间，能够发挥60 %以上的酶活；最适反应温度为60 ℃，在50～70 ℃之间能够发挥70%以上的酶活，说明该酶为酸性木聚糖酶。

T2-2-1所产木聚糖酶最适反应pH为5.0，随着pH下降，酶活急剧降低，在pH 5.0～8.0之间，能够发挥60 %以上的酶活；最适反应温度为50 ℃，在30～70 ℃之间能够发挥60%以上的酶活，说明该酶是一种酸性木聚糖酶。

3 讨 论

现阶段，对于木质纤维类的废弃物的开发利用是畜牧业、饲料业乃至整个轻工业的研究热点，中国木质纤维类废弃物种类多、数量大，如果能够对其进行充分的开发利用，有利于推进中国畜牧业的可持续发展，在一定程度上缓解饲料资源短缺的现状。木质纤维类物质中半纤维素的降解能够增加其他酶与底物的接触机会，而含量较多的半纤维素为木聚糖，因此有效水解木聚糖有利于木质纤维类物质的高效利用。目前研究较多的产纤维素酶或半纤维素酶微生物是真菌，且大多需要对其所产酶进行纯化后添加在底物中发挥作用，而如果能开发一种产木聚糖酶益生菌，可直接用于木质纤维类物质的发酵，能够实现在降解纤维大分子的同时分泌活性产物，包括各种酶类、活性肽类等。本研究筛选到的3株产木聚糖酶菌皆为芽孢杆菌，包括高地芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，它们与枯草芽孢杆菌的亲缘关系较近，芽孢杆菌是比较常见的一种用于单胃动物的益生素，而枯草芽孢杆菌也在中国制定的《允许使用的饲料添加剂品种目录》中，可对其进一步开发，作为靶向降解木聚糖的发酵菌种或者编码木聚糖酶蛋白基因的供体菌，用于新型饲料添加剂的开发利用。

酶发挥作用的关键是合适的反应条件，饲料添加剂中木聚糖酶发挥作用的环境主要有两种，一个是动物体外环境，反应条件易控；另一个是动物体内环境，根据动物消化道的不同位置，温度和pH有所差异。酸性酶可在动物的胃部发挥作用，对大分子进行降解，中性酶可在家禽的嗉囊和小肠中发挥作用，碱性酶可在小肠中发挥作用。有研究报道称，饲料用酶若要在动物消化道中发挥作用，需要在40 ℃左右，pH 4.8左右具有较好活性。本研究中筛选获得的产酶微生物所产的木聚糖酶为中性和酸性木聚糖酶，在动物体内胃部和肠道中能发挥一定的水解作用。目前关于产木聚糖酶微生物的研究发现，大多数碱性木聚糖酶产自芽孢杆菌，大多数酸性木聚糖酶产自木霉、曲霉和青霉，而本研究中筛选获得产中性和酸性木聚糖酶芽孢杆菌，拓宽了产木聚糖酶芽孢杆菌的应用范围。

自然界中的微生物资源十分丰富，目前已经被分离到的微生物仅仅占自然界微生物资源的小部分，而其中得到有效开发利用的更是少之又少，因此，掌握高效的筛菌方法才能够从自然界浩瀚的微生物资源中筛选到最理想的菌株。样品的选择是筛菌的第一步，也是决定筛菌成功与否的关键。本研究发现动物胃肠道中微生物的多样性与动物生长环境中的微生物多样性息息相关，针对3株菌共同做的系统发育树分析中发现从土壤中筛选获得的芽孢杆菌T2-2-1与从山羊瘤胃内容物中筛选获得的芽孢杆菌YL3-2-1以及从山羊粪便中筛选获得的芽孢杆菌YF-2-1有着较近的亲缘关系。也有研究发现，从山羊瘤胃内容物中分离获得的1株芽孢杆菌与中国某地区蜈蚣草根际土壤中分离的1株芽孢杆菌(KP986945)亲缘关系较近，推测可能随牧草进入瘤胃中，说明山羊瘤胃中微生物多样性可能极大程度受到山羊采食植物及周边土壤中微生物多样性的影响，而粪便中微生物多样性也由此受到影响，由于反刍动物会将瘤胃食物进行反刍咀嚼，瘤胃内微生物多样性可能也同样会影响到放牧土地生态环境中的微生物多样性。因此，选择筛菌样品时，除了动物消化道和粪便外，还可扩大范围，将动物生长环境中的水、土壤或植物作为第二样品，进行目的菌的分离筛选，提高筛选成功的几率。

4 小 结

本研究从土壤、山羊瘤胃内容物和山羊粪便中各筛选出1株产木聚糖酶芽孢杆菌，通过形态学和分子生物学方法分别将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；对其进行系统发育树分析发现山羊瘤胃微生物多样性可能受到土壤微生物多样性的影响；对其所产木聚糖酶的酶学特性进行分析后发现，最适反应条件分别为50 ℃、pH 5.0，60 ℃、pH 7.0和60 ℃、pH 5.0，3株菌均能够分泌蛋白酶，其中YF-2-1与T2-2-1具有明显的产蛋白酶特性。产木聚糖酶芽孢杆菌的获取为新型饲料添加剂和生物饲料的制备提供材料，来自土壤和动物消化道产木聚糖酶微生物的遗传学分析也为筛菌样品的选择提供了理论依据。