全二维气相色谱-飞行时间质谱结合ROAV法解析山茱萸挥发性风味组分

李 栋，张立攀

（河南省商业科学研究所有限责任公司，郑州 450000）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc），又名枣皮、药枣、肉枣等，属山茱萸科山茱萸属，是我国一种传统的中药材，具有补益肝肾、涩精固脱的功效.经现代医学研究表明，山茱萸中含有环烯醚萜类、多糖、熊果酸、齐墩果酸等多种化学成分，在降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等方面也有一定作用.

山茱萸在我国分布较为广泛，其中河南省是山茱萸的主要产区，重点分布在洛阳、南阳山区，是河南省优势地方植物资源.这些地区有将山茱萸作为水果食用的传统习惯.2019年1月，国家卫生健康委发文《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》（国卫食品函〔2019〕311号），将山茱萸在河南省按照传统既是食品又是中药材的物质（食药物质）开展生产经营试点工作.这预示山茱萸在食品领域有着很大的发展前景.风味是食品的一个重要特性，对山茱萸挥发性风味物质的研究对其今后在食品领域的开发研究具有现实意义.

全二维气相色谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）分析是20世纪90年代初才兴起的一种新型的分析技术.它通过调制器将分离机理不同而又相互独立的两根柱子串联起来，较传统的一维气相色谱，GC×GC峰容量更大、分离速度更快、灵敏度更高等.使得全二维气相色谱-质谱技术在食品分析领域得到越来越广泛的应用，尤其在分析葡萄酒［1］、白酒［2-4］、牛肉肉味香精［5］、烟草［6］、茶叶［7］等风味分析方面有很显著的优势.

香气活度值（odor activity value，OAV）可以比较全面地评价风味物质对气味贡献的大小，它同时考虑了化合物含量及香气阈值两个因素，但由于计算OAV值需要化合物的绝对含量，而通常分析鉴定出的化合物种类较多，进行准确的定量十分复杂.刘登勇等［8］提出了相对香气活度值（relative odor activity value，ROAV）的概念，在不用确定化合物绝对含量的情况下，即可量化评价不同挥发性物质对总体风味的贡献程度，进而确定关键风味化合物.ROAV值越大的组分对样品总体风味的贡献也就越大，且ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的化合物对样品的总体风味具有重要的修饰作用［9］.

目前已有文献对茱萸保健酒［10］、利口酒香气［11］、山茱萸种子提取物成分［12］进行分析，也有对山茱萸提取物应用于卷烟增香的研究［13］.关于山茱萸风味的研究还比较欠缺，胡劲光等［14］采用水蒸气蒸馏法结合GC-MS法对山茱萸果实的香气进行过分析，本课题组也采用SPME-GC/MS法对山茱萸进行过分析［15］，但目前采用GC×GC-TOFMS法对山茱萸挥发性物质进行分析的文献还未见报道.所以本文采用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE）法对山茱萸中的挥发性成分进行富集提取，通过GC×GC-TOFMS分析，结合保留指数及质谱比对进行化合物鉴定，并进一步采用ROAV法评价化合物对山茱萸风味的贡献.对山茱萸挥发性组分的研究，有助于山茱萸风味香精的开发，扩大山茱萸在食品领域应用，为产品开发提供指导.

1 材料与仪器

山茱萸，河南省西峡县；正构烷烃C7～C30，Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；DF101S水浴锅，江苏科析仪器有限公司；SDE装置（定制），山东莘县京兴玻璃仪器有限公司；FA2004电子天平，上海衡际科学仪器有限公司；GGT 0620全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪，广州禾信仪器股份有限公司；CTC PAL RTC全自动多功能在线前处理进样平台，瑞士CTC公司.

2 试验方法

2.1 同时蒸馏萃取（SDE）

将50 g山茱萸和250 mL水加入500 mL三孔圆底玻璃烧瓶中，置于SDE装置的一端，130℃油浴加热，机械搅拌.50 mL二氯甲烷于100 mL圆底烧瓶中置于SDE装置的另一端，45℃水浴加热，磁力搅拌.连续提取3 h.萃取液加入适量的无水硫酸钠干燥，Vigrex柱浓缩至5 mL，氮吹至1.5 mL.按如上进行两次平行实验.

2.2 全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）

气相色谱条件：第一维色谱柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），第二维色谱柱为DB-17（1.1 m×0.18 mm×0.18 μm），进样口温度为280℃，进样1 μL，不分流进样；载气为氦气，流速为1.0 mL/min；柱箱采用程序升温，起始温度为40℃，保持3 min，以4℃/min升温到280℃，保持3 min.调制柱为HV调制柱（1.2 m×0.25 mm），调制周期为5 s，其中解析时间为1 s；N2补偿气为0.15 MPa，同步GC升温程序，调制器进口比柱箱高30℃，调制器出口比柱箱高120℃.

飞行时间质谱条件：电子轰击源，电离能70 eV；离子源温度为230℃，接口温度为250℃；采集质量范围40～500 amu，采集速度为100谱/s，检测器电压为-1800 V；溶剂延迟3 min.

2.3 数据分析

采用全二维数据处理工作站软件Canvas载入数据，自动绘制全二维TIC轮廓图，并对图中信噪比大于100的峰自动识别，标识出的每一个峰点即代表一种化合物，每个化合物由一对保留时间确定，X轴方向为第一维保留时间（min），Y轴方向为第二维保留时间（s）.进一步通过对每个化合物的质谱图进行谱库比对检索、结合保留指数等信息，对化合物进行定性分析；采用峰面积归一化法计算相对含量.

3 结果与分析

3.1山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析

采用同时蒸馏萃取法对山茱萸中的挥发性物质进行富集，SDE萃取物进一步通过GC×GC-TOFMS分析，并对化合物进行鉴定，得到山茱萸挥发性风味组分的构成.图1为山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析三维色谱图.由图1可以看出，一维色谱柱分析时会有很多共流出的化合物，所以仅靠一维色谱柱的分析，会使得化合物的鉴定十分困难.它们在二维色谱柱上能够很好地分离.说明全二维气相色谱分析在分离复杂化合物时具有更显著的优势，分离效果更好，从而也会使得鉴定结果更加准确.

山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析化合物分析鉴定结果见表1.

通过对每个化合物的质谱图进行谱库比对检索、结合保留指数等信息，选择正反匹配度均大于700的化合物作为鉴定结果；采用峰面积归一化法计算相对含量，共鉴定出包括醛类、酮类、醇类、酯类、饱和烃类、烯烃类、芳香烃类、杂环类、其他类共计105种化合物，分别为15种、6种、24种、7种、22种、13种、8种、3种和7种.质量分数较高的为醇类（32.01%）、醛类（18.23%）和烯烃类（13.82%）.

醇类鉴定出了24种化合物，其中质量分数较高（＞1%）的化合物有1-辛烯-3-醇、1-辛醇、反式-氧化芳樟醇、芳樟醇、α-松油醇、桉油烯醇、异桉油烯醇、依兰-4，10（14）-二烯-1β-醇、.tau.-Muurolol、榧烯醇、α-毕橙茄醇.桉油烯醇、异桉油烯醇、.tau.-Muurolol和榧烯醇常见于植物挥发油的分析检测中，.tau.-Muurolol在香椿叶中有被检测出［16］，α-毕橙茄醇具有清香、青草香，在茶叶香气分析时被检测到［17］.

醛类物质多具有青香，是对香气贡献较大的一类化合物.在山茱萸中鉴定出的醛类物质中质量分数在1%以上的有3-甲基丁醛、戊醛、己醛、辛醛、壬醛、α，4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛和衣兰烯醛.其中己醛、辛醛均具有青草香气，质量分数分别为3.47%、2.09%.衣兰烯醛的质量分数为2.18%，在玫瑰花、楠木叶片精油中均检测到该物质［18-19］.

图1山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析三维色谱图Fig.1 Three-dimensional chromatogram of extracts from Cornus officinalis by SDE of GC×GC-TOFMS analysis

烯烃类共鉴定出13种，质量分数占13.82%.其中β-愈创木烯的含量较高，大于3%.鉴定出的烯烃类物质中还有柠檬烯、胡椒烯、石竹烯、γ-依兰油烯、α-依兰油烯、α-去二氢荜澄茄烯，质量分数分别为0.46%、1.39%、0.49%、0.24%、1.50%、0.52%.柠檬烯是一种单萜烯化合物，常见于柑橘类水果的精油中，具有典型的柠檬香气，现已被广泛应用于食品、香料等行业［20］.柠檬烯、胡椒烯、石竹烯在胡椒精油中都有被检测出.γ-依兰油烯、α-依兰油烯存在于依兰油中，具有辛香、木香.鉴定出的烯烃类物质中很多为萜烯类化合物，是植物中广泛存在的一种次生代谢产物，是甲戊二羟酸衍生的具有（C5H8）n通式的链状或环状的烯烃类衍生物，主要靠植物体内的生物合成产生，参与植物香气的形成，因而在分析植物的挥发性物质时常常被检测到［21］.

酮类和酯类物质鉴定出的化合物数量相对较少，质量分数分别为3.57%、4.92%，种类分别为6种、7种.酮类中6，10，14-三甲基-2-十五烷酮的质量分数最高，为1.93%.

其他化合物的含量均比较低.酯类物质中含量最高的化合物为十六酸甲酯，质量分数为1.14%.

杂环类物质共检测鉴定出3种，其中质量分数最高的为甲基吡嗪，为3.82%；饱和烷烃共鉴定出22种，占9.22%；其他类化合物共包含7种，总量占到5.5%.

表1山茱萸果实GC×GC-TOFMS分析结果Tab.1 The analysis results of Cornus officinalis by GC×GC-TOFMS

续表

续表

3.2 山茱萸挥发性风味物质的ROAV分析

通过查阅文献获得化合物的气味阈值［22］，结合表1中化合物的含量计算山茱萸挥发性风味物质的ROAV见表2.

表2 山茱萸风味物质ROAVTab.2 ROAV of the flavor compounds of Cornus officinalis

由表可知，ROAV≥1（由大到小）的组分有（E）-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、壬醛、芳樟醇、庚醛、辛醛、2-十一烯醛、1，2-二氢-1，1，6-三甲基萘、（E）-2-辛烯醛、戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、甲基吡嗪、（E）-2-癸烯醛、1，1-二乙氧基乙烷、反式-氧化芳樟醇，这些化合物是山茱萸的关键风味化合物.0.1≤ROAV＜1（由大到小）的化合物有1-辛醇、癸醛、α-松油醇、（E）-6，10-二甲基-5，9-十一碳烯-2-酮、1-壬醇、1-癸醇、对二甲苯、石竹烯、（Z）-2-庚烯醛，这些化合物对山茱萸的风味具有重要的修饰作用.

其中3-甲基丁醛和壬醛的ROAV值分别为19.89、11.75，相对较高，说明它们对风味的贡献比较大.通过比较可以看出，1-辛醇的含量是3-甲基丁醛的4倍左右，但3-甲基丁醛对风味的贡献却远超过1-辛醇，这就是两种化合物气味阈值差异较大造成的.

山茱萸关键风味物质中醛类占了10种，是贡献最大的一类化合物.其中，己醛具有青草香以及青苹果的气味.辛醛具有青香、柑橘香、脂肪香.戊醛、庚醛和壬醛均具有青香.3-甲基丁醛为支链醛，阈值很低，仅为0.002 mg/kg，具有很强的挥发性，呈现出果香、黑巧克力香.（E）-2-辛烯醛具有油脂香、霉香，（E）-2-壬烯醛具有黄瓜味，（E）-2-癸烯醛具有青香.1-辛烯-3-醇具有典型的蘑菇味.芳樟醇具有清新的花香，是一种常用的香料物质，是白兰花挥发油中的主要成分［23］.反式-氧化芳樟醇可由芳樟醇氧化得到，也具有甜香、花香气息，普遍存在于多种天然植物中.虽然在含量上，反式氧化芳樟醇比芳樟醇高，但由于芳樟醇的阈值仅有0.005 3 mg/kg，所以其ROAV值比反式氧化芳樟醇高很多，对山茱萸风味有很大贡献.吡嗪具有坚果香，烤香，且香味阈值较低，为0.06 mg/kg，对风味影响较大.正是这些化合物气味之间的相互作用，共同构成了山茱萸主体的青甜果香气息.

α-松油醇具有丁香、松针香的气息，在哈密瓜中被检测到［24］.辛醇具有甜味，1-壬醇、1-癸醇分别具有青香、油脂香.石竹烯具有木香气.它们都对山茱萸的总体风味起着一定的作用.

续表

4 结论

通过SDE法对山茱萸的挥发性风味物质进行提取，结合全二维气相色谱-飞行时间质谱分析，共分析鉴定出了105种化合物，其中包括醛类（15种）、酮类（6种）、醇类（24种）、酯类（7种）、饱和烃类（22种）、烯烃类（13种）、芳香烃类（8种）、杂环类（3种）、其他类（7种）.质量分数较高的为醇类（32.01%）、醛类（18.23%）和烯烃类（13.82%）.较本课题组之前的研究结果，由于使用了GC×GC-TOFMS分析，鉴定出了更多种化合物，在化合物含量和种类上的差异与风味富集方法的不同存在一定关系.但分析结果显示含量和种类较多的化合物同样是醇类、醛类和烯烃类，这与之前的分析结果一致.

通过ROAV分析，发现醛类物质对山茱萸风味起着重要的作用，其中比较关键的风味化合物有（E）-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、壬醛、庚醛、辛醛、2-十一烯醛、（E）-2-辛烯醛、戊醛、己醛、（E）-2-癸烯醛.此外，醇类中的芳樟醇、1-辛烯-3-醇、反式-氧化芳樟醇也对风味有着较大的贡献.计算ROAV时化合物阈值多来源于文献资料，不同化合物在不同基质中呈现出的阈值也存在差异，且有些化合物未能找到阈值，因此会对结果产生一定的影响.可以采取气相色谱嗅闻、电子鼻等分析手段进一步确定山茱萸的关键香气物质，从分子感官角度研究山茱萸风味物质之间的相互作用，对山茱萸在食品领域的应用提供参考.