纳米银粒子的生物制备，表征及抗菌性研究

郭文阳，张宗源，潘梦诗，周留柱，亓兰达，徐宏光，张英涛

（河南省科学院生物研究所有限责任公司，郑州 450008）

近年来人们越发重视安全健康的生活环境，预防日常生活中各种致病微生物的侵扰，以致消毒剂的使用和需求量与日俱增，抗菌消毒技术也在加速发展［1］.目前杀菌消毒剂仍然以有机和无机杀菌剂为主，其中以金属纳米材料为主要成分的无机杀菌剂是研究热点之一［2］.金属纳米材料一般指粒径尺寸在1～100 nm之间的材料，因其颗粒小，比表面积大，常常表现出独特的量子尺寸效应和表面效应，不同于普通的金属物质［3-4］.特别是纳米银材料，因其独特的物理化学性质和优异的抗菌性能，被广泛应用于电子、光学、生化、航天和医药等众多领域［5］.目前纳米银的制备方法主要分为化学法、物理法和生物法.其中，化学法是利用还原剂将银离子还原生成纳米银粒子，因其合成过程迅速，粒径大小可控，并且可大量制备，成为制备纳米银的主流方法［6-7］.但是化学法需要用到一些有毒有害的试剂，比如柠檬酸钠、乙二醇、硼氢化钠等，往往会对环境安全和人体健康造成一定的威胁，不利于可持续发展.物理法主要包括真空气体冷凝法、高压磁控溅射法、激光烧蚀法和机械研磨法，这些方法对仪器的性能要求都比较高，制备条件苛刻、成本高，不利于大规模生产.目前新兴的、符合可持续发展的生物法逐渐成为制备纳米银的研究热点.生物法制备纳米银是利用生物中存在的某些物质或者在其生长代谢过程中分泌、转化得到的成分，与金属盐溶液反应得到金属纳米粒子，其中包括植物类、微生物类、藻类、碳水化合物、生物类聚合物等［4，8］.有研究表明植物类浸提物［9-11］、水果浸提物［12-13］等物质都含有许多具有还原性和稳定性的化学成分，可作为还原剂将Ag+转化为纳米银，得到纳米银的粒径大概在5～60 nm之间，并且这些成分还能对制备的纳米银粒子形成覆盖隔离的效果，以减少粒子间的团聚［14-15］.浸提法制备纳米银的反应过程比较快，但需要用到各种萃取剂和提取液，对温度要求比较高，工艺复杂.而基于微生物介导的方法制备纳米银具有绿色环保、成本低廉、工艺简单等优势，此方法合成的纳米银产品必将具有更大的市场潜力［16］.

纳米银粒子的抗菌性随粒径的减小而增强，以纳米银为主要成分的消毒剂一直在被研究和推广，相对于酒精、过氧化氢、含氯消毒剂等物质，它安全、无刺激性气味、具有广谱的杀菌性、药效持久，并且不易于产生耐药性.目前报道的通过一些微生物合成纳米银的研究有很多［18-19］，并取得了相应进展，但有效制备纳米银的菌种有很大的局限性，并且制备的纳米银粒径较大，抗菌作用不够突出.本研究利用已筛选的一种真菌黑曲霉HQ-1，可以简易快捷、低成本地制备小粒径纳米银，并具有良好的抑菌活性，可为纳米银抗菌材料的发展提供理论依据.

1 实验

1.1 实验材料

黑曲霉菌（Aspergillus niger）：从河南省郑州市金水区东风渠河道土中筛选得到，经AgNO3驯化后将其命名为HQ-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.22415.

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌：来源于河南省科学院生物研究所有限责任公司.

AgNO3：分析纯，购买自郑州派尼化学试剂厂.

PDA和PDB培养基：购买自北京奥博星生物技术有限责任公司，pH 7.2±0.2.

实验用水全部为去离子水.

1.2 实验设计

将土样中筛选的菌株用含有AgNO3的PDB培养基，在30℃、180 r/min条件下，驯化培养3 d，培养基中AgNO3的浓度依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L（以下mol/L记作M），挑选含5.0 mM AgNO3的培养基培养后的耐银菌株，经微生物菌种鉴定为黑曲霉菌（见下文2.1）.取驯化筛选得到的黑曲霉HQ-1接种到PDA培养基，待菌丝长满培养基表面，然后进行传代培养，确保菌株的生长活性.菌株接入100 mL PDB液体培养基，置于30℃、150 r/min的恒温摇床保持3 d，之后过滤得到菌丝体；然后用无菌蒸馏水清洗4次，除去培养基成分，将滤得的菌丝体加入100 mL无菌蒸馏水中重悬，同样条件下培养1 d，之后再次过滤得到二次发酵滤液.取100 mL滤液于250 mL的锥形瓶中，添加1.0 mL的AgNO3溶液（100 mM），放入25℃的恒温培养箱中反应1 d，分别在正常（不做光照处理）和光照的条件下进行合成纳米银的实验.同时取100 mL黑曲霉的二次发酵滤液，不添加AgNO3溶液，作为实验的空白对照组.对制备的纳米银溶液进行表征分析，通过溶液的紫外吸收峰强度、电镜图、Zeta电位值以及溶液中颗粒的形貌、大小、分布情况等参数，分析纳米银的生成情况.最后应用牛津杯法分析本研究实验制备的纳米银对常规致病菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌效果.

1.3 样品性能及表征

对实验用的HQ-1菌送到深圳微生太科技有限公司进行鉴定，得到HQ-1的基因序列，将序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与HQ-1序列相似性最大的物种信息.将制备的纳米银溶液混合均匀，用移液器吸取2.5 μL，利用超微量紫外可见分光光度计（Nanodrop 2000）对制备的纳米银溶液进行紫外扫描检测，根据紫外吸收峰的出峰情况，判断纳米银的生成效果.溶液中纳米银的形貌特征用钨灯丝透射电镜（JEM-1200EX）观察，制样观察流程为：首先对纳米银溶液样品做稀释和超声处理；然后将封口膜平铺在玻璃片上，用镊子把铜网夹放在封口膜上，用移液枪吸取10 μL样品滴在铜网上，等待10 min之后用小片滤纸将多余液体吸走；最后计时60 min，待铜网自然晾干之后放在透射电镜样品台上观察.溶液中纳米银粒径大小和Zeta电位值利用马尔文激光粒度仪（Zetasizer Nano ZS90）测量，其步骤为：取约2.0 mg样品，加至有1.0 mL纯水的样品池中，超声震荡5 min，使样品完全分散，进行测量.纳米银对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果采用牛津杯法，通过观察抑菌圈大小进行实验.

本研究的整体实验及相关分析流程如图1所示.

图1 实验流程Fig.1 Flow diagram of experiment

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉HQ-1的鉴定

对实验筛选的HQ-1菌序列，在NCBI核酸数据库中进行比对，根据得到的结果，利用MEGA-X软件制作系统进化树，得到结果如图2所示.可明确看出，与测试物种HQ-1序列相似性最大的物种为黑曲霉（Aspergillus nigerATCC 16888），并且根据NCBI中比对的结果，两者的序列相似性达到了99.8%，基本可以确定本实验筛选的HQ-1为黑曲霉菌属.

图2HQ-1系统进化树Fig.2 HQ-1 phylogenetic tree

2.2 紫外全波长扫描（UV-Vis）

众所周知，纳米银溶液是一种相对稳定的胶体体系，在扫描波长为410～440 nm之间能出现明显的特征吸收峰.对本实验条件下制备的纳米银溶液，利用超微量紫外分光光度计进行全波长扫描，得到光谱图的结果如图3、图4所示.从图3中可以看出，合成进行1 d之后，正常组的反应液在420～440 nm波长之间，并未出现明显的紫外吸收峰，意味着溶液中未有纳米银生成；然而在同样的波段间，光照组的反应液出现了特别明显的紫外吸收峰，初步说明溶液中生成了纳米银，这与前人的研究成果相一致［20-21］.另有研究表明，微生物生长代谢之后的发酵液中存在还原性酶之类的物质，可以使溶液中的金属离子被还原［22-23］.推测黑曲霉在发酵过程中也有还原性的物质产生，在光照的条件下，可以使Ag+被还原成小颗粒的银单质形成纳米银溶液，或许这是反应液能合成纳米银的主要原因.图4反映的是光照条件下纳米银溶液反应1 d、20 d、40 d的紫外吸收情况，从中可以看出，随着反应时间的增加，光照条件下制备纳米银溶液的紫外吸收峰强度并未降低，反而有小幅度的上升，说明溶液中纳米银浓度有所增加；其最大吸收峰的位置没发生红移或蓝移，意味着纳米银粒径未发生变化，整体纳米银溶液一直比较稳定，未出现明显聚沉现象.因此，由以上结果可看出，光照条件下利用黑曲霉HQ-1能快速合成纳米银，并且稳定性良好.另外需要指出的是，反应溶液的紫外吸收图谱并非光滑的曲线，分析可能是由于黑曲霉HQ-1发酵液中存在一些蛋白、多糖、脂肪酸之类的物质影响了紫外可见分光度计入射光的平稳吸收所导致.对此，后续研究将进一步优化实验方案，尽可能降低发酵液导致的不利影响.

图3 纳米银溶液的紫外吸收光谱图Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution

图4 光照下纳米银溶液的紫外吸收光谱图Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution under light

2.3 透射电子显微镜（TEM）观察

目前制备纳米银的方法多样，通过不同实验方法制备的纳米银粒子大小和结构各有不同，比如已报道的纳米银有球形［24］、管柱形［25-26］、块状［27-28］、线形［29］、锥型［30］等形貌，纳米银的形貌特征、尺寸大小与反应介质和添加AgNO3的浓度有很大关系［31］.本研究使用分辨率大约为1.0 nm的透射电子显微镜对光照条件下制备的纳米银溶液进行观察，分析反应溶液中纳米银的形貌、分散情况，评估粒径大小，得到透射电镜的结果如图5所示.

图5 纳米银溶液的透射电镜图Fig.5 TEM image of nano-silver solution

从图5中可以看出，不管是在200 nm还是50 nm的尺度下观察，纳米银粒子在溶液中是分散开来的、表面光滑的圆球形颗粒，仅有少量聚集，直观来看颗粒大小均在20 nm以下.纳米银粒子在反应溶液中分布相对较均匀，没有出现大量团聚的情况，能够稳定存在.

2.4 粒径大小分析

利用马尔文激光粒度仪测量光照条件下制备纳米银的动态光散射（DLS）粒径，根据统计结果，绘制得纳米银颗粒的体积分布如图6所示.纳米银颗粒尺寸主要集中在10 nm以下，很少部分出现在10～100 nm之间.同样的，从饼状图中的统计结果可以看出，制备纳米银的粒径范围很窄，主要集中在3～10 nm之间，占比高达93.4%，粒径大小在10～100 nm之间的纳米银颗粒体积占比约为6.0%，其余大于100 nm的颗粒仅占比0.6%.根据已知的研究结果，利用纳米银作为杀菌剂有效成分，其粒径越小，杀菌效果越好.本实验制备的纳米银粒径分布集中，有很大的抗拒优势.另外，在同等条件下，将纳米银粒径做到10 nm以下的研究成果并不多见，表明利用黑曲霉HQ-1发酵液制备纳米银粒子的方法，有很大的可行性和研究价值.

图6 纳米银粒子的体积分布图Fig.6 Volume distribution of nano-silver

2.5 Zeta电位分析

众所周知，胶体溶液中分散粒子的表面都带有一定的电荷，彼此间会相互排斥和吸引，以致最终会形成一个相对平衡的状态，使得溶液体系稳定存在.Zeta电位可用来评价微粒分散体系的物理稳定性，是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量.一般Zeta电位绝对值越高，溶液中粒子间的静电斥力越大，其物理稳定性也就越好.基于此，对光照条件下制备的纳米银溶液测量Zeta电位值，得到的结果如图7所示.从图7中可以明显看出，纳米银溶液的Zeta电位值在-50～-20 mV之间，电势的峰值体现在-30.5 mV的位置，其电位绝对值整体高于20 mV，以此说明本方法制备的纳米银粒子在溶液中的静电斥力较大，分散体系有良好的物理稳定性.

图7 纳米银溶液的Zeta电位图Fig.7 Zeta potential diagram of nano-silver solution

2.6 纳米银的抑菌性分析

选取实验室保藏的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种常规致病菌，各自接种后，在37℃、150 r/min恒温的条件下培养2 d，得到菌悬液，经梯度稀释、涂板、测定，可知大肠杆菌的浓度为4.0×108CFU/mL，金黄色葡萄球菌的浓度为7.0×108CFU/mL.分别取200 μL菌悬液均匀涂布到LB培养基上，之后在培养基上放置3个无菌牛津杯，然后各取200 μL在光照条件下制备的纳米银溶液、空白发酵液和1.0 mM AgNO3溶液做对比，加入牛津杯中，分析制备的纳米银溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果.扣除空白发酵液的抑菌影响，根据抑菌圈大小作图，得到的实验结果如图8所示.从图8中可知，AgNO3和纳米银对大肠杆菌的抑菌圈平均直径分别为16.2 mm和14.8 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径分别为16.8 mm和15.3 mm.两者对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较接近，但整体以AgNO3的抑菌效果略占优势，此结果与杨婧等［32］的研究结论相一致.然而，AgNO3产品在市场上不允许流通，将其作为消毒产品有很大的局限性，所以纳米银在抑菌材料方面有很大的应用潜力.已有研究表明：纳米银粒子的粒径越小，其抗菌作用越强，并且随着粒径的减小，其抗菌的类型也更加广泛，进而表现出广谱的抗菌性［17，33］；纳米银的粒径越小，比表面积越大，进而释放银离子的效果越强烈.因此，分析纳米银粒子产生抑菌性的原因可能是：一方面是粒径较小的纳米银可以透过细胞膜，阻碍细胞代谢和分裂，从而加速细胞的死亡［34］；另一方面是Ag+带有较强的正电荷，更易于和微生物表面的负电荷结合，进而溶解细胞膜、改变细胞的通透性、抑制细菌脱氢酶的活性，破坏细胞DNA的结构，最终达到杀灭微生物的目的［35］.

图8 抑菌实验结果Fig.8 Bacteriostatic test results

3 结论

本实验初步探究了筛选、驯化的黑曲霉HQ-1的发酵滤液与AgNO3反应制备纳米银粒子的情况.经过一系列的表征和分析，发现在光照条件下，黑曲霉HQ-1的发酵液可与1.0 mM AgNO3快速反应制备纳米银粒子；制备的纳米银溶液中有93.4%的粒径分布很窄，集中在3.0～10.0 nm之间，比文献报道的最小粒径进一步降低，且分散性良好；另外，制备的纳米银粒子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性基本达到了同样浓度AgNO3的抗菌效果，且其稳定性和市场流通性远高于AgNO3，可为抗菌材料的发展与推广提供支持.