双柱双检测器顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量的方法验证

赵顺新

(南京康宁司法鉴定中心，江苏 南京 210000)

酒精对人的神经系统有一定的抑制作用，可以使人思维迟钝，甚至产生幻觉。当前酒后驾车已经被列为车祸致死的主要原因。随着新交通法的实施，酒驾相关的检测也日趋普遍，而乙醇含量是认定行为人是否醉酒驾驶的关键性证据。驾驶员血液中乙醇浓度大于等于20 mg/100 mL小于80 mg/100 mL为饮酒后驾车，大于等于80 mg/100 mL则为醉酒后驾车[1]。

随着科学技术的发展，出现了各种各样检测血液中乙醇含量的方法，包括酶法、化学法、顶空气相色谱法和顶空气相色谱-质谱法[2-5]等。其中，顶空气相色谱法是最为常用并被纳入公共安全行业标准的方法。目前能够适用的检验方法为GA/T 1073—2013[6]和GA/T 842—2019[7]。《司法鉴定/法庭科学机构能力认可准则》[8](CNAS-CL08:2018)7.2.1.5鉴定机构在引入方法之前，应验证能够正确运用该方法，以确保实现所需的方法性能要求。并保留方法验证的记录，当方法发生变更或修订时，应重新进行适当程度的验证。

在检测血液中乙醇含量的过程中，检测人员、所使用的仪器设备、标准品溶液、检测方法、环境条件等都会影响检测结果，这些均为血液中乙醇检测不确定度的来源。不确定度越大，检测结果距离真值越远，不确定度越小，检测结果距离真值越近，所以不确定度也可以反应一个实验室的检测水平[9,10]。

本文参照GA/T 842—2019标准，并依据GB/T 27417—2017《化学分析方法确认和验证指南》[11]和《法医毒物分析方法验证通则》[12]，利用双柱双检测器顶空气相色谱法对血液中乙醇含量的测定进行方法验证，证实笔者所在实验室具备使用该标准方法的条件，能够按照方法要求出具科学、准确、公正的实验数据。

1 材料与方法

1.1 仪器

PerkinElmer Clarus 500气相色谱仪(铂金埃尔默股份有限公司)，PerkinElmer TurboMatrix40顶空自动进样器(铂金埃尔默股份有限公司)，100 μL移液枪，1 000 μL移液枪。

1.2 试剂

乙醇标准溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL，纯度≥99.9%，sigma aldrich)，叔丁醇(纯度≥99.8%，sigma aldrich)，血液中乙醇样品-1，血液中乙醇样品-2(司法部司法鉴定科学研究院)。

1.3 溶液的配制

叔丁醇内标溶液：称取适量的叔丁醇标准品置于500 mL容量瓶中，添加去离子水至刻度，混匀，得500 mg/100 mL叔丁醇对照品标准储备溶液，将储备液用水稀释得4 mg/100 mL叔丁醇内标工作液。

1.4 实验方法

1.4.1 HS-GC条件

PerkinElmerClarus 500气相色谱仪，色谱条件：毛细管色谱柱A柱：Elite-BAC1(30 m×1.8 μm×0.32 mm)；B柱：Elite-BAC2(30 m×1.2 μm×0.32 mm)；柱温：50 ℃；检测器：火焰离子化检测器(FID1，FID2)；检测器温度：200 ℃；进样口温度：250 ℃。PerkinElmer TurboMatrix40顶空自动进样器，顶空炉温：65 ℃；取样针温度：90 ℃；传输线温度：110 ℃；样品瓶加热平衡时间10 min。

1.4.2 校准曲线制备

分别移取100 μL系列浓度乙醇标准溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL)，加入20 mL顶空瓶中，然后均加入500 μL叔丁醇内标工作液，每个浓度点的标准溶液独立重复测定5次。每个浓度点后均分析空白样以评价延迟效应。

1.4.3 样品分析

分别移取100 μL血液中乙醇样品-1和血液中乙醇样品-2血样各两份，加入20 mL顶空瓶中，然后加入500 μL叔丁醇内标工作液，作顶空进样分析。

2 结果

2.1 校准曲线和延迟效应

按实验方法对系列浓度乙醇标准溶液进行测定，乙醇的质量浓度在5.0～300.0 mg/100 mL范围均未见延迟效应。

用乙醇浓度值为横坐标，乙醇与叔丁醇内标的峰面积比为纵坐标，5次重复测量数据叠加作图，得到校准曲线见图1和图2，标准曲线残差值的分布见图3和图4。在浓度范围5～300 mg/100 mL内，A通道的线性回归方程为Y=0.010 983X-0.019 970，相关系数R2=0.999 967；B通道的线性回归方程为Y=0.011 148X-0.012 749，相关系数R2=0.999 947，两个通道的线性相关系数R2均大于0.999，标准曲线残差值以0为中心随机分布，因此线性方程回归成立，且绘制的校准曲线线性良好，满足日常检测分析的需要。

图1 A通道校准曲线Fig. 1 Linear regression equation of channel A

图2 B通道校准曲线Fig. 2 Linear regression equation of channel B

图3 A通道标准残差值Fig. 3 Standard residuals of channel A

图4 B通道标准残差值Fig. 4 Standard residuals of channel B

2.2 检出限和定量限

选择三个来源不同的空白血液，逐步稀释乙醇标准溶液，每个批次重复测定三次，同时记录乙醇的信噪比，S/N≥3且符合定性要求的添加样品最低浓度为1 mg/100 mL，即为方法的检出限。定量限为校准曲线最低浓度点(5 mg/100 mL)，且此浓度点能满足精密度和准确度的要求。

2.3 回收率和精密度

取同一空白血样3份，分别添加乙醇标准溶液，使血液中乙醇的质量浓度分别为5 mg/100 mL、50 mg/100 mL和150 mg/100 mL。每个浓度点配制三个质控样，连续测定5天，计算日内精密度、日间精密度和回收率，见表1，表2。

表1 日内精密度实验结果(n=3)Tab. 1 Results of within-day precision(n=3)

表2 回收率和日间精密度实验结果(n=15)Tab. 2 Results of recovery rate and day to day precision(n=15)

结果表明该方法两个通道进样的日间精密度和日内精密度的相对标准偏差RSD均小于5.0%，说明测定数据间的波动性小。A通道的回收率在99.32～101.40%之间，B通道的回收率在99.40～100.20%之间，说明该方法回收率良好。即本方法精密度和回收率均符合日常检测的需要。

2.4 样品分析

2020年5月8日本中心收到2个标称“血液中乙醇含量测定-1”和“血液中乙醇含量测定-2”的能力验证样品，将其编号为NL-2020-12-1和NL-2020-12-2。用所建立的方法对样品进行分析，结果见表3。本实验室选择将相对标准偏差较好的A通道的数据反馈给能力验证提供方。经确认，能力验证结果为满意，此方法能满足中国合格评定国家认可委员会能力验证计划样品测定的需要，同时也能满足本实验室法医毒物相关样品分析的需要。

表3 能力验证样品测定结果Tab. 3 Results of proficiency testing samples

2.5 不确定度

2.5.1 A类不确定度

来源于重复测定次数、检测人员。

将质量浓度为80 mg/100 mL的血样平行测定10次，结果如下：A通道：79.15、79.74、78.89、79.23、79.58、79.52、80.09、80.38、79.02、80.37 mg/100 mL；B通道：78.22、79.63、78.64、78.99、78.11、79.02、79.41、80.29、79.04、80.13 mg/100 mL来计算不确定度。

测定结果标准偏差：

(1)

测定平均值的相对标准不确定度：

(2)

经公式2计算：A通道样品平行测定产生的相对标准不确定度urel(A)=2.16×10-3，B通道样品平行测定产生的相对标准不确定度urel(A)=2.92×10-3。

2.5.2 B类不确定度

来源于校准曲线、乙醇标准溶液纯度、移液器、气相色谱和实验室环境等。

2.5.2.1 校准曲线产生的不确定度

由以下公式可以计算校准曲线产生的不确定度:

(3)

SE为标准曲线峰面积残差的标准差;

(4)

SXX为标准溶液浓度残差的平方和；

(5)

urel(X)为校准曲线产生的相对标准不确定度。

经计算，A通道由校准曲线产生的相对标准不确定度为7.10×10-3，B通道由校准曲线产生的相对标准不确定度为4.99×10-4。

2.5.2.2 乙醇标准溶液引入的相对标准不确定度

乙醇标准溶液产生的不确定见表4。

表4 乙醇标准溶液纯度的不确定度Tab. 4 Uncertainties of ethanol standard solution

2.5.2.3 移液器

(1) 取内标用移液器产生的相对标准不确定度

(2) 取血样用移液器产生的相对标准不确定度

2.5.2.4 气相色谱仪引入的相对标准不确定度

2.5.3 相对标准不确定度

相对标准不确定度分量的评定见表5：

表5 相对标准不确定度分量一览表Tab. 5 Components of relative standard uncertainty

由以上分析可知，不确定度主要来源于样品平行测定、校准曲线、对照品纯度和气相色谱仪，其余来源的不确定度可忽略。由合成标准不确定度公式计算出相对合成标准不确定度μrel=1.10×10-2(A通道)，μrel=1.02×10-2(B通道)。

实验结果一般用扩展不确定度表示。扩展不确定度是由合成标准不确定度的倍数表示的测量不确定度，通常用符号U表示。它是将合成标准不确定度扩展k倍，k称为包含因子。k值一般取2～3，多数情况取k=2。即U=k×μrel=2×1.10×10-2×79.60=1.75 mg/100 mL(A通道)；U=k×μrel=2×1.02×10-2×79.15=1.61 mg/100 mL(B通道)

本方法测得样本中乙醇含量为：(79.60±1.75)mg/100 mL,k=2(A通道)；(79.15±1.61)mg/100 mL,k=2(B通道)。

3 结论

本次方法验证线性范围，检出限和定量下限均满足GA/T 842—2019《血液酒精含量的检验方法》的要求。高、中、低不同浓度血样测定结果的相对标准偏差满足生物样品定量分析方法的RSD控制在15%以内的要求，精密度良好。A通道的回收率在99.32～101.40%之间，B通道的回收率在99.40～100.20%之间。证明本实验室检测血液中酒精含量的精密度和回收率能够满足方法的要求。通过方法验证，确认GA/T 842—2019方法在本实验室可行、适用。