马源人乳头瘤病毒23型的鉴定及遗传进化分析

贾陈阳，佟盼盼，宋小珍，邓海峰，段汝丽，帕丽旦·努尔兰，任美灵，张 磊，况 玲，谢金鑫*

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.伊犁哈萨克自治州昭苏马场，新疆 昭苏 835602）

乳头瘤病毒（Papillomavirus，PV）属于乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）家族，是一种小的无囊膜的双链DNA 病毒。PV 宿主范围广泛（包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类）[1]。迄今为止，已鉴定的人和动物源PV 类型超过650 种[1]，其中人PV（Human papillomavirus，HPV）为440 种；马乳头状瘤病毒（Equus caballus papillomavirus，EcPV）1、2、3、4、5、6、7、8 和9 型，牛乳头状瘤病毒（Bovine papillo⁃mavirus，BPV）1、2和13型以及HPV-18[2]。

研究表明HPV-23 感染可引起人疣状表皮发育不良、皮肤癌、眼部神经鞘瘤、非生殖器皮脂溢性角化病，并与乳腺癌等的发生有关[3]。HPV 致癌性依赖于E6 和E7 癌基因的持续表达，E6 基因可通过与泛素蛋白连接酶E6AP 结合来靶向p53 的泛素化和蛋白水解；E7基因可结合pRB并使其肿瘤抑制功能失活。通过这些相互作用导致细胞周期控制机制的紊乱和DNA修复的缺陷，从而导致基因组不稳定和恶性转化的风险增加，而E6 和E7 癌基因的转录受共同启动子p97 的控制，该启动子主要受HPV E2 基因产物的抑制[4]。因此，E2基因在抑制HPV致癌过程中发挥了重要作用。

目前尚未发现动物源HPV-23。本研究首次在马中检测到HPV-23并对其进行遗传进化分析，为HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品 在伊犁、昌吉市、乌鲁木齐市马场采集马鼻拭子样品，其中乌鲁木齐市马场鼻拭子样品30份，伊犁、昌吉市马场鼻拭子样品152份，-80 ℃保存。

1.2 主要试剂 病毒DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Geneaid 公司；DL2000 DNA Marker 购自TaKa⁃Ra 公司；2×TransStart®FastPfu FlyPCR SuperMix 购自全式金生物技术有限公司。

1.3 样品处理及高通量测序 参考本实验室已建立的宏病毒组学样品处理方法[2]，将182 份鼻拭子样品100 000 r/min 超速离心2 h，浓缩50 倍，0.17 mL 浓缩液经过DNase I 和RNase A 酶，37 ℃消化1 h；消化后的样品采用DNA/RNA 提取试剂盒进行总核酸的提取，使用带有Barcode 序列的随机引物经反转录得到cDNA，然后使用Klenow 酶合成第二条链，得到dscD⁃NA，随后使用带有Barcode 序列的PCR 引物进行单引物扩增。将随机扩增获得的DNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化合格后由上海派森诺生物技术股份有限公司进行高通量测序（Illumina HiSeq X-ten）。

1.4 病毒组学分析 基于Illumina HiSeq X-ten 高通量测序平台，采用鸟枪法（Shotgun）测序策略，扩增片段经超声打碎到450 bp 左右，构建鼻拭子组测序文库；对上述构建的测序文库进行双端（Paired-end，PE）测序。测序得到的原始序列（10GB）首先去除低质量和简单重复reads，得到高质量的clean data；然后使用bmtagger 去除宿主污染，采用Trinity 软件从头（De novo）组装拼接，得到的拼接序列（Trinity.fasta）与NCBI-NR数据库进行BLASTX比对（E值设定为＜0.001）。结合拼接序列在各样本中的表达量数据，获得各样本在各个分类等级（界、门、纲、目、科、属、种）上的活性病毒组成分布。注释到病毒的序列在Virus-host database 数据库（http://www.genome.jp/virushostdb/view/）中检索相关的哺乳动物宿主信息，以获得马鼻拭子中的病毒组[2]。

1.5 引物设计与合成 参照注释到的HPV-23 E2 基因（KY652675和U31781），采用Primer 5.0软件设计特异性引物：5'-TCCAAATACGCAGATGAGCC-3'/5'-AG⁃GAGGTG GTAGATTCTTCGG-3'，由青岛派森诺生物技术股份有限公司合成。

1.6 HPV-23 E2 基因的PCR 扩增及序列分析 按照Geneaid 试剂盒方法提取马鼻拭子样品DNA，以其为模板，采用1.5 的引物经PCR 扩增E2 基因，反应条件：94 ℃2 min；94 ℃20 s、55 ℃20 s、72 ℃30 s，共35个循环，72 ℃5 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。从GenBank中获取相关序列，利用MEGA7.0.26软件采用最大似然法（Maximum likelihood methods）构建E2 核苷酸序列系统进化树，步展值重复1000 次进行评估。

1.7 数据分析 采用IBM SPSS Statistics 21.0 进行数据分析。单因素分析采用x2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 病毒宏基因组学分析 对采集的马鼻拭子样品经常规处理、PCR 扩增后经病毒宏基因组学分析显示，共产生90 048 090 个测序读长（reads），有90 048个reads（占全部序列的0.01%）注释到哺乳动物病毒[PV（7 081 reads）、疱疹病毒（6 443 reads）、圆环病毒（1 175 reads）、反转录病毒（17 169 reads）和小双节RNA病毒（58 180 reads）]，其中有1 039条reads注释到HPV-23 E2基因，与HPV-23参考株E2基因序列同源性为98.2%～99.4%，表明马携带HPV-23，这是首次报道动物携带HPV-23，也是首次在新疆检测到该病毒。

2.2 HPV-23 E2 基因的PCR 扩增结果 利用E2 基因特异性引物对182 份鼻拭子样品进行PCR 检测结果显示，乌鲁木齐市30 份汗血马鼻拭子样品中有5 份（G2、G3、G4、G8 和G11）呈HPV-23 阳性，阳性率16.7%，部分汗血马鼻拭子样品HPV-23 E2 基因的PCR 结果见图1；伊犁地区52 份纯血马鼻拭子样品中有1份呈HPV-23阳性，阳性率1.9%；昌吉市100份纯血马鼻拭子样品中有1 份呈HPV-23 阳性，阳性率1%。表明不同地域、不同品种马匹均携带HPV-23，乌鲁木齐汗血马HPV-23 的阳性率高于伊犁和昌吉纯血马，且差异显著（P＜0.05）。PV具有严格的种属特异性，马源HPV-23的发现，表明HPV-23与HPV-18和BPV-1、BPV-2和BPV-13相似[2,5]，具有跨种感染马的能力。

图1 部分马鼻拭子样品HPV-23 E2基因的PCR检测结果Fig.1 PCR detection of HPV-23 E2 gene in partial nasal swab samples of horses

2.3 HPV-23 E2 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析 利用MegAlign 软件分析结果显示，7 份马源HPV-23 E2 基因序列和氨基酸序列之间的同源性分别为98.5%～100%、96.4%～100%，其中昌吉HPV-23 CJ-31、伊犁HPV-23 YL-39 和乌鲁木齐HPV-23 WLMQG2、WLMQ-G3、WLMQ-G11 E2基因和氨基酸序列同源性为100%。将7 条马源HPV-23 E2 基因序列提交至GenBank，获得登录号为：MW855281～MW855287。将马源HPV-23 E2 基因序列和氨基酸序列与GenBank登录的2条人源HPV-23、9种EcPVs E2基因和氨基酸序列比对分析结果显示，7 条马源HPV-23 E2 基因序列和氨基酸序列与德国（U31781）、英国（KY652675）人源HPV-23 E2 基因序列和氨基酸序列同源性分别为98.2%～99.4%、95.5%～99.1%，与EcPVs E2基因和氨基酸序列同源性分别为44.2%～55.1%、18.2%～29.4%，提示马源HPV-23 可能是由人传至马。HPV-23 报道较少，GenBank 中仅有两条HPV-23 序列信息。我国虽有人感染HPV-23 的相关报道，但无HPV-23 序列信息[6]，因此不确定马源HPV-23是国内流行株，还是随马匹贸易进入国内的外来病毒株。

2.4 HPV E2 基因遗传进化树分析 以德国（U31781株）、英国（KY652675 株）2 株HPV-23、EcPVs 以及其他类型HPV 为参考株，利用MEGA7.0.26 软件构建E2基因的进化树，结果显示马源HPV-23与人源HPV-23英国株形成独立进化分支，与人源HPV-23 德国株亲缘关系较近，并与HPV-5、HPV-8 和HPV-20 同处于β 属乳头瘤病毒（Betapapillomaviruses）进化分支（图2），其他人和马源PV属成员亲缘关系较远，进一步提示马源HPV-23可能是由人传至马。

图2 HPV-23 E2基因的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic analysis of HPV-23 E2 gene nucleotide sequences

HPV-23 可在人健康皮肤表面和口腔中检测到，并且可以持续数年[7-8]。在紫外线（UVR）的照射下，HPV-23会增加非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）的风险，包括鳞状细胞癌（SCC）和基底细胞癌（BCC）[9]。NMSC是白人中最普遍的恶性肿瘤，其患病率在许多欧洲国家逐年上升[10]。本研究在马鼻拭子样品中检测到HPV-23，但未观察到马匹表现任何临床症状，因检测的马匹数量有限，对于马匹是否为HPV-23 的健康携带者有待进一步监测。马源HPV-23 具有潜在感染人的风险，对公共卫生安全产生威胁，建议在接触马匹时注意个人防护。

本研究首次检测到马源HPV-23，并对其E2 基因进行遗传进化分析，为HPV-23 的流行病学研究提供了参考依据。