岩白菜素治疗特发性肺间质纤维化的研究

魏 祎，齐 鸣，黄丽羽，刘 超

0 引 言

岩白菜素是一种从多种药用植物中提取的化合物，具有抗炎[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]和抗菌[7]的作用。此外，岩白菜素还具有显著的镇咳、祛痰的特性。岩白菜素作为天然植物源产品，其来源广阔，价格低廉，具有极好的开发前景。已有研究表明，岩白菜素在博来霉素(Bleomycin，BLM)诱导的IPF小鼠模型中可以通过抑制IκBα磷酸化和p65核移位来阻断NF-κB信号传递[8]。岩白菜素还可以激活Nrf2抗氧化应激通路。上调E-钙黏蛋白，下调纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白的表达，减弱IPF小鼠模型中成纤维细胞的积累，抑制肺上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)样改变[9]。然而，目前对于岩白菜素治疗IPF的作用尚未进行更多深入的研究。本研究采用BLM构建IPF小鼠模型，给予岩白菜素灌胃给药28 d，研究岩白菜素通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路进而治疗IPF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级C57BL/6雄性小鼠50只，6～8周龄，体重(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2021-0006。所有动物饲养于室温23～25 ℃、相对湿度(40±10)%、暗/光循环12 h的环境中。自由饮食饮水。

1.2药物和试剂BLM(货号M2100)购自美国Abmole公司；地塞米松(纯度 99%，B25793)、岩白菜素(纯度≥98%，B21429)购自上海源叶生物科技有限公司；HE 染色试剂盒(C0105)、Masson三色染色试剂盒(G1340)购于北京索莱宝科技有限公司；Collagen III抗体(22734-1-AP)、CHOP抗体(15204-1-AP)、ATF4抗体(10835-1-AP)、PERK抗体(24390-1-AP)购于美国Proteintech公司。

1.3仪器H1850-R型冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，QL-866型混匀仪(Vortex Mixer公司)，光学显微镜(日本Nikon公司)，蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司)。

1.4方法

1.4.1 分组、造模与给药小鼠经适应性饲养7 d后，按随机数字表法分为对照组(不作任何处理)、模型组(BLM 5 mg/kg气管内滴注制作模型)、阳性药组(造模后给予地塞米松5 mg/kg灌胃)、岩白菜素高剂量组(造模后给予岩白菜素100 mg/kg灌胃)、岩白菜素低剂量组(造模后给予岩白菜素50 mg/kg灌胃)，每组10只。模型组于第0天气管内滴注BLM，剂量为5 mg/kg，构建小鼠IPF模型，造模次日开始药物干预，岩白菜素使用DMSO溶液溶解，每日分别给予阳性药组、岩白菜素低剂量组、岩白菜素高剂量组5 mg/kg地塞米松、50 mg/kg、100 mg/kg岩白菜素灌胃，对照组每天给予等渗盐水0.2 mL灌胃，持续给药28 d。

1.4.2生物样本收集与处理取小鼠右侧肺组织，称小鼠肺湿重，计算肺指数公式如下：

肺指数=肺湿重(mg)/体重(g)×100%

刘崐辞世后，家里一贫如洗，家人对他的安葬成了最大的问题。他的弟子门生感其为人，凑足一万两银子，合力把他的遗体埋葬在岳麓区的一处山丘，并置下墓地墓庐，墓名为“皇清诰授光禄大夫湖南巡抚刘公韫斋府君之墓”。 2010年6月，长沙市文物局在第三次全国文物普查中，在岳麓区含浦镇玉江村罗家湾发现了刘崐的墓,由此揭开了该地“学士”名称的来历之谜。后人因对他的怀念，将其墓地附近的一条路命名为学士路。当今，在含浦镇有一个村落叫学士村，有一个收费站叫学士收费站，有一条大道叫学士路,有一所学校叫周南学士实验学校。人们自发地缅怀着纪念着刘崐,他已永远活在湖南人民心中。

然后用10%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋切片后切成厚度约0.4 cm厚的组织薄片，进行HE染色、Masson染色，之后于100倍光学显微镜下观察切片，并根据Ashcroft标准[10]评分量化肺纤维化程度，得分越高说明纤维化程度越严重。最后在显微镜下观察切片并拍照。

1.4.3免疫荧光检测肺组织中Collagen III将石蜡切片放入二甲苯中浸泡脱蜡后再水洗，放于SSC溶液中进行抗原修复，与5%山羊血清孵育1 h，4 ℃温度下与一抗孵育过夜。第2天用PBS冲洗掉一抗后，将载玻片与二抗在室温下孵育1 h。再用PBS冲洗掉二抗后，加入DAPI进行核染色。

1.4.4q-PCR检测肺组织中PERK、ATF4、CHOPmRNA表达水平取适量肺组织，提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板，按照试剂盒说明分别加入引物和qPCR Mix等，PCR反应条件：95 ℃15 min，95 ℃20 s，60 ℃ 30 s，40个循环。熔解曲线分析：温度65～95 ℃，每升温0.5 ℃采集一次荧光信号。引物设计见表1。

表 1 q-PCR引物序列

1.4.5Western-blot 法检测肺组织中PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平提取肺组织匀浆中的总蛋白，BCA 法检测蛋白质浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜，使用 5%脱脂奶粉封闭，2 h后孵PERK、ATF4、CHOP一抗(稀释比1∶2000)，4 ℃过夜，洗膜后孵二抗，室温孵育2 h，显色曝光，凝胶成像系统观察，分析蛋白水平变化，其中，以β-actin为内参蛋白。使用Image J软件对条带灰度值进行量化分析。

2 结 果

2.1 小鼠体重和肺指数变化模型组小鼠体重减轻和肺指数较对照组增加(P<0.05)。阳性药组、岩白菜素高剂量组、岩白菜素低剂量组小鼠体重较模型组上升，肺指数下降(P<0.05)。见图1、图2。

图 1 小鼠体重变化曲线比较

与对照组比较， *P<0.01；与模型组比较， #P<0.01

2.2岩白菜素对小鼠肺组织形态学的影响与对照组比较，模型组小鼠肺组织的Ashcroft评分增加(P<0.05)；经过给药干预后，阳性药组、岩白菜素高剂量组、岩白菜素低剂量组的Ashcroft评分较模型组降低(P<0.05)。见图3。与对照组比较，模型组小鼠肺泡间隔塌陷，肺组织正常结构丧失，胶原纤维沉积过多，视野内可见成团的纤维组织。岩白菜素低剂量组仍可见连续的纤维化组织，岩白菜素高剂量组、阳性药组肺组织结构出现不同程度的修复，可见到正常的肺泡结构，融合成团的纤维化灶明显减少。见图4。

与对照组比较， *P<0.01；与模型组比较， #P<0.01

图 4 岩白菜素对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织的影响

2.3岩白菜素对IPF模型小鼠中Collagen III表达的影响与对照组比较，模型组小鼠中Collagen III的荧光强度明显升高；与模型组比较，阳性药组、岩白菜素高剂量组、岩白菜素低剂量组干预的荧光强度降低。见图5。

图 5 岩白菜素对BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中Collagen III免疫荧光的结果

2.4岩白菜素对IPF小鼠肺组织中PERK、ATF4、CHOPmRNA表达水平的影响与对照组比较，模型组IPF小鼠肺组织中PERK、ATF4、CHOPmRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，岩白菜素各剂量组和阳性药组肺组织PERK、ATF4、CHOPmRNA表达下降(P<0.05)。见表2。

表 2 岩白菜素对IPF小鼠肺组织ATF4、CHOP、PERK mRNA表达的影响

2.5岩白菜素对IPF小鼠肺组织PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平的影响与对照组相比，模型组小鼠肺PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平升高；阳性药组、岩白菜素高剂量组、岩白菜素低剂量组肺组织的PERK、ATF4、CHOP蛋白表达降低(P<0.05)。见图6，表3。

1:对照组; 2:模型组; 3:阳性药组; 4:岩白菜素高剂量组; 5:岩白菜素低剂量组

表 3 岩白菜素对各组小鼠ATF4、CHOP、PERK蛋白表达的影响

3 讨 论

IPF是一种特殊形式的间质性肺炎，可导致进行性、不可逆的肺瘢痕化，在5年内约有50%的患者因呼吸衰竭而死亡[11]。目前，越来越多的证据表明，中药有助于改善IPF症状[12-14]。岩白菜素因其多种药理活性而受到广泛关注，本研究证实岩白菜素抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路，起到缓解IPF的作用。

BLM是一种用于多种肿瘤化疗的常用药物，因其能诱导建立IPF小鼠模型而被广泛应用于基础科研中[15-16]。本次研究中，利用BLM气管内滴注造模，与对照组相比，模型组小鼠体重下降，肺脏指数明显上升。肺组织病理分析发现肺泡细胞变性，炎症浸润，大量胶原纤维沉积，肺泡间隔被破坏，可见成团的纤维化灶，这些表明造模是成功的。经过岩白菜素干预后，小鼠体重上升，肺指数下降，肺组织病变改善，提示岩白菜素可以缓解BLM诱导的IPF模型。

IPF的主要特征是成纤维细胞增殖、激活和ECM的过度沉积[17-18]。上皮-间充质转化(EMT)是指上皮细胞失去细胞粘附特性，获得迁移、侵袭、产生ECM组分等间充质特性的生物学过程[19]，EMT在IPF中起着关键作用[20]。有研究表明，肺泡上皮细胞，特别是II型肺泡上皮细胞，通过EMT获得成纤维细胞表型，促进IPF的进展[21]。Collagen III参与构成ECM的骨架，在细胞的迁移和发育中起作用[22]。本研究通过免疫荧光检测Collagen III的表达，发现在IPF模型中Collagen III表达明显升高，经地塞米松、岩白菜素干预后，表达下降，这与预期是相符合的。

本研究基于内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路进行实验验证。PERK/ATF4/CHOP信号通路是内质网应激的重要通路，激活该条通路可以加重IPF程度。本研究也证实，模型组小鼠肺组织PERK、ATF4、CHOPmRNA表达以及PERK、ATF4、CHOP蛋白表达均明显上升，经岩白菜素治疗后其表达量降低。内质网(ER)是一种特殊的细胞器，负责维持蛋白质稳态。任何干扰蛋白质加工的因素都可能导致错误折叠的蛋白质在内质网中积累，这种情况被称为内质网应激[23]。研究表明，内质网应激标志物在IPF患者的肺组织中很常见，在IPF进展中发挥着关键作用[24]。内质网应激影响成纤维化细胞向肌成纤维细胞的分化，肌成纤维细胞是成纤维细胞的激活亚群，可以产生大量的胶原纤维和细胞外基质成分[25]。内质网应激可以进一步介导细胞凋亡、EMT、炎症反应参与IPF的进展[26]。细胞凋亡是包括IPF在内许多器官纤维化疾病的关键机制[27]。其中CHOP诱导凋亡的研究最为深入，CHOP通过激活促凋亡基因和下调抗凋亡基因以调控细胞凋亡通路[28]。炎症与IPF关系密切，内质网应激途径已经被证明可以调节炎症信号通路，包括核因子κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)。此外，内质网应激可能会使巨噬细胞向M1或M2表型倾斜。研究发现，在IPF模型小鼠中，内质网应激通过CHOP促进巨噬细胞向M2方向发生极化，从而促进纤维化的进展[29-30]。

综上所述，本研究证实了岩白菜素可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路，以此起到缓解IPF的作用，为岩白菜素临床治疗IPF提供了新的证据。