罕见A1Bw亚型伴不规则抗-B研究

潘家铭，许先国，吴泳伦，孙爱农△

1.广东省中山市中心血站检验科，广东中山 528400；2.浙江省血液中心输血医学研究所，浙江杭州 310052

准确鉴定献血者血型对临床血液正确发放和安全输血至关重要[1]，输血前应正确鉴定供、受血者血型，而ABO亚型会使抗原抗体反应出现异常、减弱或消失，导致血型正反定型不符，定型出现困难[2]。由于ABO亚型很多，不同的ABO亚型常呈现独特的正反定型结果，笔者在血液检验工作中遇到1例A1Bw11亚型伴不规则抗-B标本，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 献血者，男，29岁，全自动血型仪(微孔板凝集法)ABO血型检测结果正反定型不符。正定型：抗-A 4+、抗-B不凝集，A型；反定型：A、B细胞均不凝集，AB型。该献血者自述曾在外地献血，描述当时当地采供血机构血液检验结果是A型，表明该标本血型特殊，因此需进一步研究。

1.2仪器与试剂 国产麦迪斯150-8型全自动血型仪购自深圳爱康生物科技有限公司；SHA-2型水浴恒温振荡器购自上海高致精密仪器有限公司；3种ABO-Rh血型定型检测卡购自中山市生科试剂仪器有限公司(简称生科)、达亚美中国有限公司(简称达亚美)及西班牙Diagnostic Grifols S.A.公司戴安娜(DG)品牌(简称戴安娜)；抗人球蛋白微柱凝胶卡购自戴安娜；RhD(IgM)血型定型试剂购自上海血液生物医药有限责任公司；3种不同来源的单克隆抗-A、抗-B试剂分别购自上海血液生物医药有限责任公司、长春博德生物技术有限公司、北京金豪制药股份有限公司；ABO反定型、不规则抗体检测试剂盒购自长春博德生物技术有限公司；单克隆抗-A1、-AB、-H均购自德国CE公司；Magcore自动核酸抽提仪、基因组DNA抽提试剂盒均购自中国台湾 RBC Bioscience公司；9700型PCR扩增仪、3730 DNA测序仪和Big Dye®Terminator V3.1 测序试剂盒均购自美国ABI公司。所有试剂均在有效期内。

1.3方法

1.3.1血型血清学检测 (1)ABO正反定型检测：用盐水试管法及3种ABO-Rh(CDE)检测卡，于不同温度下进行ABO正反定型检测,其中反定型加大1倍血浆量。(2)血浆不规则抗体筛查及鉴定：分别用盐水试管法及间接抗人球微柱凝胶法进行试验。(3)红细胞吸收及放散试验：按《全国临床检验操作规程》[3]操作，对比吸收前后血浆抗体效价变化，并把吸收后红细胞在56 ℃进行热放散，放散液分别与标准A、B、O型红细胞反应。(4)血浆吸收及放散试验：分别用1份A型及B型献血者红细胞，与4倍该献血者标本血浆混合，4 ℃放置1 h，吸收后血浆与标准A、B、O型红细胞反应；同时将吸收后的A型和B型献血者红细胞做放散试验，取放散液与标准A、B、O型红细胞反应。(5)血浆不规则抗体滴度检测：将献血者标本血浆倍比稀释，与标准B型红细胞 4 ℃反应30 min，离心观察结果。

1.3.2基因检测 用Magcore自动核酸抽提仪进行基因组DNA抽提，用PCR扩增仪扩增ABO基因第1～7外显子序列，扩增产物直接测序，测序结果用SeqScape V2.5软件进行序列分析，依据碱基基本情况判定标本基因型，步骤按试剂说明书和文献[4]进行操作。

2 结 果

2.1ABO血型检测结果 从正定型抗-B反应结果来看，对于弱凝集的结果判断，试管法比微柱凝胶卡反应更敏感；试管法正定型抗-B在反应温度4 ℃及24 ℃时显微镜下可见微弱凝集，而37 ℃无凝集；反定型试管法用10份单份B细胞与该献血者血浆反应，24 ℃无凝集，但4 ℃放置30 min，离心观察，肉眼均可见凝集(1+)。结果提示该献血者可能红细胞上有A1抗原、血浆内有极弱抗-B。另外，ABO检测卡于24 ℃反应结果与全自动血型分析仪结果相同，但在4 ℃条件下用不同厂家检测卡所做反定型结果有差异。见表1、2。

2.2血浆不规则抗体筛查鉴定结果 4 ℃及24 ℃盐水试管法及37 ℃间接抗人球微柱凝胶法同时检测，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛查细胞结果为阴性，可排除该献血者血浆中ABO以外的不规则抗体存在。

表1 不同条件下盐水试管法ABO正反定型结果

表2 3种ABO检测卡正反定型结果

2.3红细胞吸收及放散试验 该献血者标本红细胞对抗A吸收能力强、放散能力弱，对抗B吸收能力弱、放散能力强，疑似标本红细胞有正常A抗原和弱B抗原，显示该献血者红细胞具有ABO亚型的特征。见表3。

表3 红细胞吸收及放散试验结果

2.4血浆吸收及放散试验 该献血者血浆标本中抗体仅可被B型细胞全部吸收干净，证明其血浆中含不规则抗-B，但是吸收后的B型红细胞放散试验却为阴性，可能由于血浆中抗-B效价太低的原因。

2.5血浆抗-B抗体效价 分别在盐水试管法和抗人球蛋白介质中检测献血者血浆抗-B效价，结果显示盐水试管法效价为1∶2，属IgM，而抗人球蛋白中结果为阴性。

2.6基因检测结果 DNA测序结果显示，该献血者标本ABO基因与ABO*A1.01参考序列相比，外显子区域存在c.297A/G、c.526C/G、c.657C/T、c.695T/C、c.703G/A、c.796C/A、c.803G/C、c.930G/A共8处变异，均为杂合变异。除c.695T/C外，其余位点符合ABO*A1.01/B.01杂合子特征。经检索c.695T>C为ABO*BW.11等位基因特征，该变异能导致232位亮氨酸转变为脯氨酸，故该献血者ABO基因型为ABO*A1.01/BW.11，表明该献血者为罕见A1Bw亚型伴不规则抗-B。

3 讨 论

ABO血型亚型同属ABO血型抗原，但抗原结构和性能或抗原位点数有一定差异，主要是以正反定型不一致及抗原性弱为主要特征的多种亚型表型[5]。虽然ABO亚型在人群中的频率不高，但由于临床检测人群数量较大，因此在临床实际工作中常会遇到ABO亚型引起的血型定型或配血困难[6]。其中A亚型分为A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，依照A亚型的分类标准，B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel，将不符合这4类B亚型标准的其他弱表型统称为Bw[7-8]。B亚型比A亚型少，Bw又是罕见的，它在人群中出现的概率非常低，甚至在血清学上难以被分类[8]。

本研究结果显示，标本红细胞与抗-AB、-A1反应呈强凝集，与抗-H为2+凝集，可以初步排除O型，提示红细胞上含有A1抗原。所以在血型检测时，当发现正反定型不符时，可以增用抗-AB、抗-A1、抗-H参与检测，这对血型的判断有重要提示作用。结合红细胞吸收及放散试验，判断该献血者为A1B亚型，其血浆中存在低温盐水抗体，为不规则抗-B(IgM)，效价1∶2。本次血清学研究同时采用多种血清学方法进行试验，目的是利用不同方法间优势互补，提高准确性，这在疑难血型的血清学鉴定中尤为重要；另外，发现不同厂家单克隆试剂对弱凝集反应结果存在差异，这可能与不同克隆株单克隆抗血清对其检出能力存在本质差异有关[9]；血型血清学方法易受生理性、实验操作、试剂、温度、临床疾病等多种因素影响，对于一些疑难血型标本往往难以准确定型[10]。结合基因检测技术，确定该献血者ABO血型表型为A1Bw，基因型为ABO*A1.01/BW.11。

该献血者在既往献血时ABO血型检测结果有误，可能误以为其不规则抗-B与正定型“正”型相符。因此，笔者建议：(1)在正反定型不符或ABO抗体活性过低等可疑血型鉴定中，如果试验结果无肉眼凝集，应及时将细胞及血清至少在室温和4 ℃孵育30 min，并用显微镜观察，增加红细胞吸收放散试验，提高血型抗原检测的敏感性；(2)提高自身业务水平，避免因技术性原因造成漏检；(3)对凝集强度弱的标本，可选择不同厂家的试剂重复验证；(4)对一些疑难问题必须及时请示上级主管医生，进一步检查。

目前血型抗原基因突变数据库中共记录了40个Bw等位基因[11]，国内曾报道有Bw11、03、07、14、33、39等，ABw等位基因曾报道有03、07、31、19、12等，而A1Bw11亚型较为罕见。A1Bw11血清学试验与其他ABw亚型存在一定的差异，不同ABw亚型红细胞与单克隆抗-B反应凝集强度不一致，因此镜检十分重要。目前已有报道，大部分ABw亚型血浆中均存在抗-B抗体，可凝集B型红细胞，但并不引起自身细胞凝集，其原因有待探究；而ABw11与Bw11血清学相似点在于红细胞与单克隆抗-B反应为±，血浆也存在不规则抗-B，所以对ABw亚型，如果红细胞定型抗-B管弱凝集没有被发现，同时反定型B细胞管4 ℃有凝集，ABO正反定型的假相符，容易误判为A型。

该献血者由于属AB亚型，作为献血者血液，其红细胞可制备成洗涤红细胞，供AB型受血者使用，但血浆因存在不规则抗-B使用应谨慎，可作为A型血浆使用或直接报废；假如作为患者，临床输血时使用洗涤O型红细胞及AB型血浆。

根据冯晨晨等[12]报道，Bw11与A等位基因或O等位基因同时遗传时竞争现象存在明显差异，由于条件限制，未能对此献血者家系中Bw11基因的遗传展开调查。

影响血型鉴定的因素很多，包括抗原减弱、抗体减弱、ABO亚型、冷凝素干扰及ABO血型变异等[13]。血清学无法对血型准确判读时，基因检测是准确定型的最佳选择[14]，但传统的血清学检测仍然是血型鉴定的金标准，假如血清学鉴定首先发生错误，将可能导致ABO亚型漏检，甚至引起输血事故。所以日常工作中，准确的血型血清学试验分析是疑难血型鉴定的重要前提，同时将血清学检测与基因检测相结合，可提高血型鉴定的准确性，为临床输血安全提供保障。