不同复合种养模式稻田土壤细菌群落结构比较分析

宋宇 丛培东 曲贵伟 杨清海

（辽东学院，辽宁 丹东 118003；第一作者：763869365@qq.com）

土壤微生物不仅是土壤的重要组成部分，也是土壤养分循环的主要驱动力[1]。土壤微生物在调节土壤肥力、植物修复、碳氮等养分循环方面发挥着重要作用[2-4]。土壤微生物多样性可作为生态系统功能的敏感指标，指示生态环境变化和生态系统功能变化[5]。据估计，在实验室条件下培养的微生物仅占这些种群的一小部分（＜1%）。随着高通量测序技术的发展，人们对土壤微生物区系的研究也越来越深入，这为全面分析微生物群落的分类、系统发育和功能多样性提供了可能[6-8]。现代农业生产利用化肥降低了病害率并提高了作物产量，使得化肥的贡献率达到40%～60%[9-10]。但随着农业生产的高度现代化和集约化发展，大量施用化肥后造成了土壤板结、土壤微生物区系结构破坏进而降低了土壤养分转化的驱动力[11]。因此，减施化肥及寻求生物肥料代替化学肥料达到增长效力已成为当前研究的热点[12-13]。李全胜等[14]通过增施微生物肥提高了玉米干物质的积累，最终获得高产。国外相关研究表明，通过在土壤中植入PGPR（生长促进根杆菌）可增加作物根际区域微生物数量，促进植物生长[15]。进入21世纪，人们将鱼、虾、蟹和鸭等养殖生物引入稻田进行复合种养生产绿色稻米，既保持了土壤肥力，又提高了产量，取得了良好效果[16-17]。目前国内外对稻田复合种养模式的研究集中在水稻增长、病虫害控制等方面[18-20]，对稻田土壤微生物的群落结构研究还较少。本实验采用高通量测序技术对河蟹稻田（sdhxz）、非洲雁稻田（sdfyz）和龙虾稻田（sdlxz）土壤细菌群落结构及多样性进行比较分析，以为复合种养模式研究提供相关数据，并为种养工艺的改进提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

土壤样品采集于辽宁东港市北井子镇盖家坝农场。在水稻结穗期分别在河蟹、龙虾和非洲雁三种复合种养稻田上随机选5点，采集0～10.0 cm表层土壤，后将从5点采集的土样混合为1个样品，每个样品重复3次。鲜土混匀装入50 mL离心管后于-80℃冷冻保存用于多样性分析。采用E.Z.N.A.SoilDNA试剂盒（OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.）对3种土壤样品分别进行总DNA提取。用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总DNA浓度和质量。

1.2 高通量16sr RNA焦磷酸测序

在基因文库构建中，细菌16 srRNA基因通过PCR扩增，用于靶向超可变V3～V4区的引物。通用引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR程序如下：首先，95℃温度下2 min作为初始变性，然后25个循环，变性、退火和延伸温度及时间依次为95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，最后72℃延伸5 min。反应物的总体积为50μL，包括1×Pfx扩增缓冲液、0.4 mM dNTP、2 mM MgSO4、0.4μM每对引物、DNA模板10 ng/μL 1μL和2 U铂Pfx DNA聚合酶，使用TruSeq SBS试剂盒V3在Illumina Hiseq 300中对提取的DNA进行高通量测序。

1.3 细菌群落与生物多样性分析

高通量测序后，对序列进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，1个小组就是1个OUT，利用微生物生态学的定量研究（QIIME）对97%相似水平的OTU进行生物信息统计分析[21]。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在门和属水平上统计各样本的群落组成[22]。利用Mothur软件进行物种多样性、丰富度及覆盖度信息统计。

2 结果与分析

2.1 细菌群落多样性和总体结构差异

在对V3～V4区进行测序后，9个样本共获得1171636个原始序列数，用QIIME“标准管-线”过滤低质量读数并修剪引物、适配器和条形码后，如表1所示，三种模式稻田土壤分别获得24 345～30 306个高质量的有效序列数、2 168～2 540个OTU数。sdlxz的有效序列数和OTU数均高于sdhxz和sdfyz，说明sdlxz的物种数目要高于sdhxz和sdfyz。表1也展示了样品的不同复合种养模式土壤的α多样性指数变化情况。α多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量标准有Chao、Ace、Shannon、Simpson等指数。其中，Chao和Ace指数用于分析群落物种的丰富程度，数值越大表示物种种类越多；Shannon和Simpson指数是反映群落的多样性，不仅反映物种丰富度，还指示了物种的均匀度。Shannon数值越大，表示该样品中的物种多样性越高，而Simpson指数反之。sdhxz的Ace、Chao和Shannon指数均高于sdlxz和sdfyz，且sdhxz的Ace和Chao指数与sdfyz差异显著。sdhxz的Simpson指数低于sdlxz和sdfyz，说明sdhxz中土壤细菌的多样性和丰富度均高于另外两组稻田。

表1 16Sr RNA基因文库97%相似性的OTU丰富度和多样性指数比较

稀释曲线是比较生态系统中物种多样性常用的方法，本研究绘制了三种复合种养模式土壤组的稀释曲线（图1）。每组3次重复，共9条稀释曲线。结果表明，这些样品的稀释曲线不接近渐近线，表明每个样品都具有高度多样性的微生物群落，进一步测序将在每个样品中产生更多的OTUs。这些曲线表明sdlxz的OTUs高于另外两组。

图1 样品稀释曲线

Venn图可用于统计多个样本中所共有和独有的物种数目，可以比较直观的展现不同环境样本中物种组成相似性及重叠情况。图2显示，sdhxz、sdlxz和sdfyz的OUT数分别是2 540、2 570和2 168，三种稻田共有OTU数是1 638，sdhxz、sdlxz和sdfyz独有的OTU数分别是111、119和332，说明sdlxz的物种数目最多，sdfyz的独有物种数目最多。

图2 物种Venn分析图

β多样性分析是通过不同微生物群落间的物种多样性进行的组间比较分析，可探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。常用的分析方法有样本层级聚类分析、PCA分析、PCoA分析和NMDS分析等。距离Heatmap图可以呈现样本层级聚类分析结果，该图可通过颜色变化反映样本间的距离变化大小。距离越大说明样本特征值组成差异越大即2个样本越不相似。从图3可以看出，sdfyz与sdhxz和sdlxz的距离较远，说明非洲雁稻田的细菌群落结构和河蟹和龙虾稻田有较大差异；sdhxz和sdlxz的距离较近，说明河蟹稻田和龙虾稻田的细菌群落结构相近。

图3 稻田土壤细菌群落距离Heatmap图

2.2 细菌群落组成的差异

图4为门的平均相对丰度，分类序列为13个门，以变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、糖杆菌门（Saccharibacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿菌门（Ignavibacteria）为主，占90%以上。图4也显示了三种复合种养模式稻田土壤细菌群落的主要门成分。sdhxz中拟杆菌门、酸杆菌门、俭菌总门（Parcubacteria）的丰度值分别为13.6%、6.9%和1.4%，均高于另外两组。其中，俭菌总门只在sdhxz和sdlxz中有，而在sdfyz中未发现。sdlxz中变形菌门和蓝藻菌门的丰度值分别为41.8%和7.0%，均高于sdfyz和sdhxz。sdfyz中绿弯菌门和放线菌门的丰度值则分别为15.1%和13.9%，高于sdhxz和sdlxz。厚壁菌门、绿菌门和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）在三种模式的稻田土壤中均有，但丰度较低。仍有许多序列在样品土壤中丰富，但不能进行分类，说明土壤仍然是一个极具挑战性的生物多样性库。

图4 三种模式下稻田土壤门水平的细菌组成丰度图

属级的深入分析研究显示出土壤样品中优势菌群的富集趋势。每个样品中的任何一个属的相对丰度均小于7%，表明3个样品组的细菌多样性均较高。如表2所示，所有土壤样品中共获得26个属，其中优势菌属norank_f_Anaerolineaceae、norank_c_Cyanobacteria、norank_c_Bacteroidetes_VadinHA17、norank_p_Saccharibacteria和Pseudarthrobacter分别属于变形菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门和放线菌门。

2.3 细菌群落属的比较

本研究在sdhxz、sdlxz和sdfyz中各自发现了一些独特的属。sdhxz中发现Nitrospira、Geobacter、norank_c_SBR2076和norank_c_OPB35等4个特殊属；sdlxz有norank_f_Cytophagaceae特殊属；sdfyz有Llumatobacter、Paenisporosarcina、norank_f_Nitrosomonadaceae、norank_f_Saprospiraceae和Triobacillus等5个特殊属（表2）。norank_o_Sc_1_84、Sideroxydans、norank_f_Lentimicrobiaceae、norank_f_Gallionellaceae、Sulfuricurvum等5个属在sdfyz中未发现，而存在于sdhxz、sdlxz中。norank_c_SJA_15、norank_f_Alcaligenaceae和norank_c_Acidobacteria则存在于sdhxz和sdfyz中。Pseudarthrobacter和norank_f_Xanthomonadales_Incertae_sedis则在sdlxz和sdfyz田中发现，而sdhxz没有。

表2 三种模式下稻田土壤不同属的分布

3 讨论与结论

土壤是一个非常复杂的生态系统，土壤微生物在土壤中起着重要的作用。高通量测序是研究土壤微生物多样性的良好方法，可用于土壤微生物群落DNA特异性片段的高质量测序。本研究利用Illumina高通量测序技术，研究了稻田不同复合种养模式的土壤细菌群落的多样性、组成和相对丰度。研究结果揭示了不同养殖动物对微生物群落的影响。

对16SrRNA基因的V3~V4区进行测序，共获得1 171 636个原始序列和581 818个有效序列，然后在97%的相似度水平上聚类成3 101个OUT，可将细菌分为48门、115纲、223目、39科、71属、1 335种。通过与数据库的比较，发现三种复合种养模式的优势菌门相近，均为变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门和酸杆菌门，但各门在土壤样品中的相对丰度有所不同，变形菌门在河蟹、龙虾和非洲雁三种稻田的平均相对丰度分别为36.73%、41.82%和36.37%，拟杆菌门分别为15.62%、14.30%和13.32%，绿弯菌门分别为13.64%、9.42%和15.11%，放线菌门分别为6.87%、11.80%和13.92%，而酸杆菌门则分别为6.87%、11.80%和13.92%。Venn图显示，河蟹稻田、龙虾稻田和非洲雁稻田的OTU数分别是2 540、2 570和2 168，三种稻田共有OTU数是1 638，河蟹稻田、龙虾稻田和非洲雁稻田独有的OTU数分别是111、119和332，说明龙虾稻田的物种数目最多，非洲雁稻田的独有物种数目最多。这些可能与土壤结构、养分等因素有关。

变形菌门是三种复合种养模式土壤的优势菌门，研究证实，营养丰富的环境适合于该菌门的快速生长[23]。该细菌大多为革来氏阴性菌，其中许多细菌负责固氮和多环芳烃。根据以往的研究，无论作物品种还是土地管理实践的不同，酸杆菌门都是相似的[24]。肠道内的拟杆菌门数量在三种模式的土壤中占据细菌总数的1/4以上，说明其随河蟹、龙虾和非洲雁的排泄物排放到土壤中可作为肥料改良土壤。放线菌门广泛存在土壤和水生态系统中，在分解和腐殖质形成过程中起着关键作用[25]。绿弯菌门的主要营养方式是化能异养型，除此之外还包括化能自养、光能自养、光能异养及混合营养型。同一物种可随外界条件的改变切换所需要的不同营养模式，因此使得绿弯菌门可以驱动自身各种代谢与外界物质交换来获取和利用能源、碳源等参与了C、N、S等一系列重要生源元素的生物地球化学循环过程[26]。三种复合种养模式稻田土壤测序共获得26个属，每种稻田都有独有的属类。河蟹稻田有4种独有属类，龙虾稻田1种，非洲雁稻田则有5种。

国外研究证实，生物多样性越高生态系统越稳定[27]。本研究中，河蟹稻田和龙虾稻田α多样性相关指数都优于非洲雁稻田，究其原因可能是河蟹和龙虾是爬行动物且具有尖锐的足，在稻田爬行过程中能很好的疏松土壤，增加土壤的通透性，利于更多微生物生长，而非洲雁是站立行走的动物且鸭蹼扁平，在行走过程中减少了土壤的透气性，限制了微生物的生长。同时本研究结果显示，河蟹稻田细菌群落的丰富度和多样性均高于龙虾稻田，说明在三种复合种养稻田中，河蟹稻田有更好的土壤细菌生态组成。