液质联用法同时测定特殊医学用途配方食品中泛酸烟酰胺和左旋肉碱的含量

黎小兰，蔡良平，付小蓉，潘拾朝，陈彩云，吴斯燕

（汤臣倍健股份有限公司，广东珠海 519040）

随着社会的发展和生活节奏的加快，人们的饮食习惯和结构都有所改变，各类的慢性病患数量也随之上升，一些患者在生理机能上的需求跟普通人存在一定的差异，老年人机体代谢能力的衰退引起了食欲下降、胃肠道功能下降[1]，年轻的白领久坐和加班加点工作缺乏运动也有引起慢性病的危险。换言之，普通的食品已经满足不了他们的需求，所以特殊医学配方食品便迎合了他们的需求。特殊医学用途配方食品是为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢后特定疾病人群对营养素的特殊需要，经专门加工研制而成的。其可以为正在治疗、康复及机体功能维持过程中的患者提供营养支持，纠正代谢失衡，增强治疗效果，促进康复[2-4]。特殊医学配方食品在使用时需要遵守医生或营养师的建议和指导，以特定的疾病患者为使用人群，因而其在产品管理和配方上有一定的特殊性。该类产品建立在医学和营养学的基础之上，需要科学的依据来证明其安全性和有效性[5-6]。

而在特殊医学用途配方食品中添加维生素等是常见的加工配制手段。水溶性维生素，如B 族维生素中的泛酸、维B1、维B2、维B6、烟酰胺，以及近年热门的左旋肉碱，都是特殊医学用途配方食品里添加的营养素。

泛酸又称维B5、遍多酸，是一种水溶性维生素，几乎存在于所有活细胞中[7]，参与人体中类固醇、褪黑激素、抗体和亚铁血红素合成的重要物质[8]，泛酸可以加强皮肤的新陈代谢，对皮肤有水合功能，继而能改善皮肤的干燥、脱屑、粗糙、止痒等症状[9-10]。

烟酰胺与蛋白质的代谢及儿童智力发育关系密切[11]，并在维持皮肤和消化器官正常功能中起重要作用。

左旋肉碱又称肉毒碱或维生素BT，是人类必需的一种营养素，其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸氧化，为机体提供能量[12-13]。

而随着新原料、新技术及市场需求的变化，以某一类成分总量作为标志性功能成分的评判方法难以评估产品质量，因此，对特定功能成分进行有效测定，对特殊医学用途配方食品的质量控制具有重要的意义。目前，检测泛酸、烟酰胺和左旋肉碱的方法有薄层色谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法、液相色谱法、液相色谱质谱法等[14]。主要通过方法学验证以建立一种高效、准确、适用实际工作、能同时有效检测这3 种成分的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260 型高效液相色谱仪、API3200 型质谱联用仪、Agilent Eclipse XDB-phenyl 色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），美国安捷伦公司产品；EQ-500型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品。

甲醇（色谱纯）、一级用水、甲酸（色谱纯），德国CNW 科技公司提供；盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯），广州化学试剂厂提供；烟酰胺（对照品来源：SUPELCO，批号：LC22915V，纯度：99.9%）；泛酸钙（对照品来源：中国食品药品检定研究院，批号：100370-201402，纯度：97.5%）；左旋肉碱（对照品来源：Dr，批号：G139676，纯度：95.5%）。

特殊医学配方粉（主要成分为蛋白质、低聚果糖、多种维生素、DHA、EPA 等），汤臣倍健股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 液相色谱法仪器条件

液相条件：色谱柱Phenomenex，Kinetex，XBC18，100 mm×4.6 mm，3.5 μm；柱温40 ℃；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序，进样量为5.0 或2.0 μL。

流动相条件见表1。

表1 流动相条件

质谱条件：离子模式为ESI+模式；运行时间为13 min。

1.2.2 对照品溶液制备

分别精密称取泛酸钙对照品24.69 mg，左旋肉碱对照品24.94 mg 于25 mL 棕色容量瓶中，烟酰胺对照品10.20 mg 于50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸水溶解、定容，制成泛酸钙质量浓度为0.962 9 mg/mL对照品溶液，左旋肉碱质量浓度为0.952 7 mg/mL 对照品溶液，烟酰胺质量浓度为0.203 8 mg/mL 对照品溶液，作为储备液；再分别稀释为泛酸钙质量浓度为0.962 9 μg/mL，左旋肉碱质量浓度为0.952 7 μg/mL对照品溶液，烟酰胺质量浓度为0.203 8 μg/mL 对照品溶液，作为对照品使用液，摇匀，经0.45 μm 滤膜过滤后待进样。

1.2.3 供试品溶液制备

取特殊医学用途配方食品粉末约5 g，精密称定，置烧杯中，加入浓度为0.1 mol/L 的盐酸溶液约适量，室温超声处理30 min，放冷，用浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 值至4.0~4.5，转移并用水定容至50 mL 容量瓶中，摇匀后取50 mL 溶液至离心管中，以转速8 000 r/min 离心5 min，取上清液，用水稀释10 倍，经0.45 μm 滤膜过滤后，即得供试品溶液。

1.2.4 测定

精密吸取对照品溶液进样量1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL 与供试品溶液进样量5.0 μL 或2.0 μL，注入高效液相色谱仪，建立标准曲线方程。在1.2.1分析方法的条件下，进行分析测定。

质谱条件见表2。

表2 质谱条件

1.2.5 数据处理

试样中泛酸的含量按如下公式计算：

试样中烟酰胺/ 左旋肉碱的含量按如下公式计算：

式中：X——试样中泛酸的含量，%；

V——试样稀释的体积，mL；

C——试样溶液中泛酸钙/烟酰胺/左旋肉碱的浓度，mg/mL；

m——试样的质量，g；

k——单位转换系数，k=0.1；

0.92——泛酸钙换成泛酸的转换系数。

2 结果与分析

2.1 方法空白试验

称取空白样品，按1.2.4 试样制备方法处理空白溶液，按1.2.1 色谱条件测定空白溶液，与泛酸钙、左旋肉碱和烟酰胺标准溶液的出峰时间对比。

特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与泛酸色谱图（右图） 见图1，特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与烟酰胺色谱图（右图） 见图2，特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与左旋肉碱色谱图（右图） 见图3。

图1 特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与泛酸色谱图（右图)

图2 特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与烟酰胺色谱图（右图)

图3 特殊医学配方粉中空白色谱图（左图） 与左旋肉碱色谱图（右图)

空白溶液在对照品溶液的各成分出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果无干扰。

2.2 线性范围确认

2.2.1 试验数据

标准曲线见表3。

表3 标准曲线

2.2.2 线性试验结论

线性评价：相关性分别为0.999 9，0.999 5，0.999 9，所以用该方法测定泛酸、烟酰胺、左旋肉碱在质量浓度为0.2~2.2 μg/mL 呈现良好的线性。

2.3 检出限和定量限

分析方法的检出限DL 和定量限QL 由信噪比（S/N） 计算。DL 定义为S/N=3 时对应的待分析浓度，QL 定义为S/N=10 时对应的待分析浓度。

2.3.1 检出限

当信噪比（S/N） 为3 时，泛酸检出限为0.001 94 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL 时，该方法的泛酸检出限为0.019 4 μg/g；烟酰胺检出限为0.005 43 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL时，该方法的烟酰胺检出限为0.054 3 μg/g；左旋肉碱检出限为0.003 97 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL 时，该方法测定的左旋肉碱检出限为0.039 7 μg/g。

2.3.2 定量限

当信噪比（S/N） 为10 时，该方法的泛酸定量限为0.006 4 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL时，该方法的泛酸定量限为0.064 μg/g；烟酰胺定量限为0.018 1 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL 时，该方法的泛酸定量限为0.181 μg/g；左旋肉碱定量限为0.013 2 μg/mL；当称取量为5.0 g，定容至50 mL 时，该方法的泛酸定量限为0.132 μg/g。

2.4 精密度试验

2.4.1 试验方法

称取6 份样品，按1.2.3 试样制备方法处理样品，按1.2.1 色谱条件测定检测样品含量，计算其RSD（%）。

2.4.2 试验数据

精密度结果见表4。

表4 精密度结果

2.4.3 试验结论

6 份样品泛酸含量的RSD 为2.8%，烟酰胺含量的RSD 为0.7%，左旋肉碱含量的RSD 为0.7%，表明该方法有较好的精密度。

2.5 稳定性试验

2.5.1 试验方法

将样品溶液分别在室温下放置0，30，60，120，240，640 min 后，按2.2.1 条件测定峰面积，计算其RSD（%）。

2.5.2 试验数据

耐用性试验结果见表5。

表5 耐用性试验结果

2.5.3 试验结论

样品溶液分别在室温下放置0，30，60，120，240，640 min 后，RSD（%） 分别为1.8%，1.8%，1.1%，表明样品溶液在室温下8 h 内泛酸、烟酰胺和左旋肉碱的稳定性良好。

2.6 回收率试验

2.6.1 试验方法

加标：精密称取约5.0 g 样品9 份（已知样品的泛酸含量1.92 mg/100 g；烟酰胺含量为4.39 mg/100 g；左旋肉碱含量为17.20 mg/100 g），分成3 组，每组3 份，各组分别精密加入泛酸加标液（质量浓度0.096 31 mg/mL） 1.5，2.0，2.5 mL，烟酰胺加标液（质量浓度为0.225 1 mg/mL） 2.0，2.5，3.0 mL，左旋肉碱加标液（质量浓度为0.263 8 mg/mL） 0.6，0.8，1.0 mL。按2.2.3 试样制备方法处理样品。

2.6.2 试验方法

回收率结果见表6。

表6 回收率结果

2.6.3 试验结论

平均回收率分别为96.48%，97.03%，95.11%；相对标准偏差（RSD） 分别为5.3%，8.2%，6.2%。

4 结论

建立了一种酸碱沉淀法沉淀蛋白质后，经液相-串联质谱检测特殊医学配方食品中泛酸、烟酰胺和左旋肉碱含量的方法。结果表明，通过选用优化后的质谱条件下，在MRM 扫描模式下，样品中的泛酸、烟酰胺和左旋肉碱能在13 min 内实现快速分离检测，并无杂质干扰，可实现对目标物的针对性检测，并通过对该方法的检出限、空白试验、稳定性试验、线性确认、回收率试验等确认，证明该方法能同时准确快速地检测特殊医学配方食品中的泛酸、烟酰胺和左旋肉碱含量，具有快速、简单、准确、灵敏等特点，有助于实验室的分析效率，确保产品质量, 降低成本，为特殊医学配方食品中泛酸、烟酰胺和左旋肉碱含量的测定提供参考。