UPLC-MS/MS 测定豆芽中16 种硝唑和喹诺酮类抗生素残留的研究

朱小娇，张 亮，张碧宇，项林敏，周建峰

（温州市质量技术检测科学研究院，浙江温州 325000）

0 引言

市场上部分蔬菜水果在种植、流通和销售环节中存在比较严重的抗生素残留问题，其中在多批次豆芽类样品抽检中，喹诺酮类和甲硝唑类抗生素的快筛结果呈阳性[1-11]。经室外试验，恩诺沙星呈阴性豆芽在次日开始腐烂，而相对的阳性豆芽除了根部自然风干，在10 日后仍保持新鲜。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》和《豆芽卫生标准》2 个标准中均未规定喹诺酮类和硝唑等抗生素可以添加使用，可知该非法违规添加抗生素行为，目的在于抗菌保鲜，以牟取非法利益。

国内外关于检测动物源中抗生素类药物文献的方法众多[12-14]，检验方法已经较成熟，关于兽药在蔬菜中的残留检测报道却较少。其中，吴小莲[8]开发的检测过程较为复杂，试剂成本高，后期产生的有害有机废液多，不适合用于批量样品的检测。刘畅[7]运用QuEChERS 快速净化测定法只限于喹诺酮类抗生素。试验利用UPLC-MS/MS 液相色谱串联质谱，建立一种准确测定豆芽中抗生素残留的方法，能够对豆芽类中的16 种硝唑和喹诺酮类抗生素，进行准确定性和定量，可操作性强。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈中11 种喹诺酮混标（100 μg/mL），美国A ChemTek.Inc 公司提供；乙腈中5 种硝基咪唑混标（100 μg/mL），德国Dr.Ehrenstorfer 公司提供；诺氟沙星- D5（99.7%，5 mg），上海安谱公司提供；羟甲基甲硝咪- D3（99.9%，10 mg），德国WITEGA 公司提供；无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；萃取盐包（4 g 无水硫酸镁和1.5 g无水乙酸钠）、净化管、乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯），上海安谱公司提供；乙酸铵（色谱纯），美国Sigma 公司提供。

1.2 仪器和设备

Agilent1290/6470 型三重四极杆液相色谱-串联质谱，配ESI 源，美国安捷伦公司产品；IKA MS3 型涡旋振荡器，德国IKA 公司产品；SIGMA 3K15 型冷冻离心机（转速≥5 000 r/min），美国Sigma 公司产品；氮吹仪、针式滤器（0.22 μm） 有机相微孔滤膜，上海安谱公司产品；Research Plus 微量移液器，德国艾本德公司产品；Millipore 超纯水处理系统，美国Millipore 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

（1） 混合标准物质中间液（2 000 ng/mL）。分别准确移取200 μL 混合标准储备液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2） 混合内标中间液（2 000 ng/mL）。分别准确移取200 μL 内标储备液10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（3） 临用时，用空白样品前处理所得基质溶液配制成质量浓度为5，10，20，40，60，80，100 ng/mL的混合标准工作液，绘制标准曲线（内标的质量浓度为50.0 ng/mL）。

1.3.2 试样的制备与保存

将样品500 g，充分均质振摇混匀，分装至洁净容器内作为试样，于-18 ℃以下保存。

1.3.3 检测样品制备称取5 g（精确到0.01 g） 样品，放入50 mL 离心管中，准确加入25 μL 混合内标液，避光放置10 min。加入20 mL 酸化乙腈，涡旋混合3 min，再加入4 g

无水硫酸镁和1.5 g 无水乙酸钠，涡旋混匀，以转速12 000 r/min 离心5 min，使两相分层，取上层乙腈溶液，过无水硫酸钠后收集在梨形瓶中，以40℃旋蒸近干，用乙腈定容至1.0 mL，加入净化粉末涡旋混匀1 min，以转速10 000 r/min 离心5 min，上清液过0.22 μm 有机相滤膜过滤后，待测定。

1.3.4 色谱条件

Zorbax Eclipse Plus C18型色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美国安捷伦公司产品），液相流速0.2 mL/min，柱温箱温度35 ℃，进样体积2 μL，流动相A：甲醇，流动相B：水（含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸铵）。

液相色谱流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱程序

1.3.5 质谱条件

离子源：ESI 电离源，正离子模式，离子源温度350 ℃，质谱毛细管电压4 500 V，干燥气温度325 ℃，干燥气流速11 L/min，雾化器压力45 psi，监测模式：多反应监测（MRM）。

16 种硝唑和喹诺酮类抗生素的多质谱参数见表2。

表2 16 种硝唑和喹诺酮类抗生素的多质谱参数

1.3.6 化合物MRM 离子图

化合物MRM 离子图见图1。

图1 化合物MRM 离子图

1.3.7 数据处理

通过Masshunter 工作站及数据处理系统采集分析质谱图，内标定量，采用Excel 2007 进行数据表格和图表处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 萃取相物质的选择

试验以回收率作为评价参数，测试乙酸乙酯、酸化乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈4 种萃取试剂的提取效果，测试步骤参照上文。

在样品加标后，静置1 h，以萃取回收率对4 种有机试剂的提取效果进行比较。测试过程中，以酸化乙腈作为萃取液，提取效果优于纯乙腈相，尤其是对诺氟沙星- D5的提取效果降低得显著；使用乙酸乙酯和酸化乙酸乙酯的萃取效果，对喹诺酮响应抑制明显，因此选择酸化乙腈作为萃取试剂。测试中，为了延长不稳定化合物的稳定性，使用乙酸将乙腈酸化。酸性萃取剂使目标化合物变成分子状态，免除了酸性化合物的水解效应，在萃取过程中增加了酸性化合物及易受基质干扰物质的回收率。

2.1.2 萃取盐包的选择

由于豆芽含水量较高，蛋白含量不低，组合式的无水硫酸镁和无水乙酸钠相较于单独的氯化钠来说，盐析分层效果更好。而在考查不同比例的无水硫酸镁和无水乙酸钠组合后，参考数据发现4 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水乙酸钠的组合效果较好。

2.1.3 净化过程的选择

以固相萃取净化方式净化，首先考虑的是使用HLB 净化小柱，但豆芽的物质组成中油脂含量不高，不存在去油问题，且在利用HLB 小柱固相萃取净化时，需要不断活化洗脱步骤，试剂废液产生量较多、耗时长，而HLB 固相小柱成本相对较高，所以排除使用固相萃取净化法。

在通过酸化乙腈提取后，考查不同含量净化管，即无水硫酸镁和C18组合的净化效果，通过平行加标试验比较回收率。净化管组合分为I 类净化管（150 mg 无水硫酸镁+ 2.5 mg GCB + 25 mg PSA）、II类净化管（150 mg 无水硫酸镁+ 7.5 mg GCB + 25 mg PSA）、III 类净化管（150 mg 无水硫酸镁+ 30 mg GCB + 25 mg PSA）、IV 类净化管（150 mg 无水硫酸镁+50 mg GCB +50 mg PSA）。按上文进行加标制备试验，在样品完成加标后静置，以试验回收率对4 种净化管的萃取效果进行比较。

豆芽中4 类净化粉末的净化平均提取回收率比较见如图2。

图2 豆芽中4 类净化粉末的净化平均提取回收率比较

GCB，PSA 在抗生素残留检测前处理方法中是效果较好的净化吸附剂。PSA 兼具极性相互作用和较弱的阴离子交换作用，可有效从非极性样品中除去极性物质，如糖类干扰物、有机酸、脂肪酸、极性色素等。GCB 主要用来除去疏水性物质，但是2 种吸附剂的使用比例不同也会一定程度上影响对目标物的回收提取效果，依据测试数据选定以III 类净化组合作为净化组分。

2.1.4 定容试剂的选择

在确定了提取净化方式后，最后的定容液试剂比较了甲醇、酸化甲醇、乙腈、酸化乙腈的定容效果，分别对样品进行平行加标试验，乙腈的效果较其他好，故选用乙腈。

2.2 标准曲线、回收率及精密度

配制混合标准工作使用液，以MRM 的分析模式进行测定，制作标准曲线，数据显示：目标化合物质量浓度含量在10~1 000 ng/mL 内可以得到良好线性，曲线系数均高于0.99。以豆芽为样品进行加标回收试验，在1，2，20 μg/kg 的加标水平下，以测试方法萃取、净化制备样品分析测试，计算平均线性和回收率，目标化合物的回收率为60%~120%。

5 种硝唑和11 种喹诺酮抗生素的检出限、线性回归方程和加标水平的回收率及精密度见表3。

表3 5 种硝唑和11 种喹诺酮抗生素的检出限、线性回归方程和加标水平的回收率及精密度

2.3 实际样品的测定

试验依据开发的方法对市售绿豆芽、黄豆芽等120 批次进行抗生素残留检测，检出含恩诺沙星8 批，含量为10.2~112.3 μg/kg；氧氟沙星2 批，含量为7.8 μg/kg和42.4 μg/kg；甲硝唑2 批，含量为38.0 μg/kg 和41.7 μg/kg。阳性样品与浙江省市场监督管理局制定的《关于加强生猪产品、豆芽等重点食品农产品排查治理工作的紧急通知》附件2 检测结果进行比较，结果一致。结果表明，该方法前处理更加简单准确，阳性检出率与标准方法检出率一致，适用于豆芽中16 种硝唑和喹诺酮类抗生素残留的分析检测。

3 结论

通过对豆芽中抗生素药物残留所使用的萃取溶剂，萃取方法及关键色谱参数条件进行优化研究，成功建立了一种快速检测的液相串联质谱测定方法，在5~100 μg/L 范围内具有较好的线性关系，相关系数均大于0.99，加标水平在1，2，20 μg/kg 时，16 种抗生素的回收率在60%~120%，相对标准差系数小于15%。该方法适用于豆芽中16 种硝唑和喹诺酮类抗生素残留的分析检测。通过该方法能够对市场上的豆芽抗生素残留做到有效监测，对于整个食品行业安全也具有非常重要的价值，应用前景广阔。在没有明确的国家标准和行业标准的规范要求下，对行业检测具有重要的风险监测意义，同时也能更好地维护消费者的健康权益。