2-甲氧雌二醇对胎儿生长受限胎盘血管内皮功能的影响

花玉蓉，朱 怡，吴金婷，金彦琪

(南通大学附属妇幼保健院妇产科，江苏 南通 226001)

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是新生儿围产期重要疾病类型，不仅会导致新生儿病亡率增加，还会诱使患儿在成年后心血管疾病及耐糖量异常发生风险增加[1-2]。目前已经明确FGR的发生与胎盘血管重塑及滋养层细胞生物学行为异常有关，滋养层细胞与血管内皮细胞之间增殖、分化存在轻微协调机制，而这一机制需要胎盘组织分泌细胞因子参与。血管紧张素-2(angiotensin 2，Ang-2)为典型的血管生成激活因子，胎盘组织中Ang-2水平减少，一方面会抑制滋养细胞分化增殖，导致胎盘血管发育被抑制，胎盘血氧缺乏；另一方面其又可以经由抑制凋亡及促进迁移影响血管内皮细胞功能，进而导致FGR发病[3]。2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)为17β-雌二醇2号位被细胞色素P450羟化，经由儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol O-methyltransferase，COMT)催化作用形成代谢产物[4]。已有研究显示，在氧气缺乏情况下，2-ME可以经由促进滋养细胞的迁移、增殖作用诱导滋养层细胞分化为高侵袭性滋养细胞，进而促进滋养细胞侵入细胞外基质，保证正常妊娠[5]。目前已经了解到FGR的发生与胎盘发育有关，且2-ME在滋养细胞分化中发挥重要作用，而2-ME在FGR中的作用及其在胎盘血管形成中的作用尚未完全明确。因此，本研究对FGR孕妇外周血、脐血及胎盘组织的2-ME水平变化进行探讨，并应用体外细胞实验分析2-ME对胎盘血管形成的影响，为后期从代谢方面分析FGR发病机制提供参考意见。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年5月至2020年12月期间南通大学附属妇幼保健院收治的FGR孕妇66例及正常产检孕妇50例为研究对象，将其分为研究组和健康组。

纳入标准：①依据有关文献[6]中对应标准判定孕妇是否存在FGR；②均为单胎妊娠，且为孕晚期；③应用剖宫产进行分娩；④孕妇及其家属同意参与本研究，本研究获我院医学伦理委员会批准同意。排除标准：①存在心脏疾病、慢性高血压、甲状腺功能异常、肝肾疾病或者糖尿病；②存在产科合并症或者其他内科合并症；③多胎妊娠孕妇；④存在感染性疾病或者免疫异常疾病。

研究组的年龄为21～32岁，平均(26.59±4.19)岁；分娩孕周为36～40周，平均(38.29±0.94)周；孕次1～3次，平均(2.13±0.53)次；产次1～3次，平均(2.15±0.43)次。健康组的年龄为20～33岁，平均(26.79±4.53)岁；分娩孕周为36～40周，平均(38.59±0.81)周；孕次1～3次，平均(2.43±0.46)次；产次1～3次，平均(2.34±0.34)次。两组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 收集脐血和胎盘组织样本及人胎盘微血管内皮细胞

采集研究组和健康组孕妇晨起空腹静脉血2mL，待其分娩后立即收集脐血3mL，同时选取1块(1cm×1cm×0.2cm)靠近脐带附着位置全层的胎盘组织，将其置于液氮中冻存。

将人胎盘微血管内皮细胞(human placental microvascular endothelial cells，hPMEC)在达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)(含有10%胎牛血清)中培养，hPMEC细胞置于5%CO2及37℃环境下细胞培养箱中培养，至hPMEC细胞生长到80%～90%融合时需应用胰蛋白酶进行传代，获得处于对数生长期进行后续细胞增殖、迁移及小管形成实验。

1.2.2 实验材料

2-ME、COMT、Ang-2酶联免疫吸附试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，组织裂解液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白试剂盒购自上海睿时生物科技有限公司，一抗与二抗购自Bioss公司，增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)显影剂购自上海李记生物科技有限公司，hPMEC购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基购自广州市超博科技有限公司，噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)试剂盒购自北京索莱宝公司，Transwell细胞小室购自康宁医疗器械有限公司，Matrigel基质胶购自上海浩然生物技术有限公司。

1.2.3 外周血和脐血及胎盘组织指标的测定

1.2.3.1 外周血和脐血2-ME水平的测定 以1 000r/min离心10min处理标本，获得上清液，应用酶联免疫吸附试剂盒测定其水平，对应测定均按照试剂盒说明书中步骤进行操作。

1.2.3.2 胎盘组织COMT水平的测定 采用蛋白印迹法进行测定，取合适的胎盘组织，应用组织裂解液充分降解，以12 000r/min离心5min，获得上清液，抽提胎盘组织蛋白，应用BCA蛋白试剂盒测定抽提蛋白浓度，随后应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，测定目的蛋白及对应内参蛋白(GAPDH)表达情况，完成SDS-PAGE后蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenedifluoride，PVDF)上，转移完成后进行洗膜处理，应用5%脱脂奶粉进行封闭。添加一抗后，在4℃环境下进行过夜孵育，第2d洗膜后，添加二抗置于37℃环境下孵育1h。孵育完成再次洗膜，添加ECL显影剂置于暗室曝光显影。目的蛋白相对表达量为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值之比。

1.2.4 细胞实验

1.2.4.1 细胞的处理 取处于对数期hPMEC，采用胰酶进行消化，选择存在10%胎牛血清DMEM培养液调成1×105/mL细胞悬液，接种至96孔板中，应用无胎牛血清DMEM培养基培养24h，应用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L浓度的2-ME处理培养细胞，作为2-ME处理组，而空白对照组则采用等量培养基处理，各组均设定5个复孔。

1.2.4.2 细胞增殖的测定 对培养细胞应用2-ME处理后，继续培养24h、48h，各孔均添加为5mg/mL浓度、20μL体积MTT继续处理6h，6h后将孔内液体吸去，应用酶标仪测定570nm位置吸光度值，最后相对抑制率=(1-2-ME处理组/空白对照组)×100%，最终结果为3次测定的均值。

1.2.4.3 细胞迁移的测定 应用无血清培养基将消化后细胞配置成1×105/mL悬液，以100μL/孔接种到Transwell细胞上室中，下室则需要添加存在10%胎牛血清培养基500μL，培养12h后将其中培养液弃去，补充10%胎牛血清培养基，在37℃环境下培养48h，用棉签将上层没有迁移细胞轻轻擦去，应用4%多聚甲醛固定，出现结晶紫颜色后置于100倍镜下随机选择5个视野，计算迁移细胞数目，最终结果为3次测定的均值。

1.2.4.4 小管形成的测定 在培养板底部添加0.3mL的Matrigel基质胶，将其铺平后，在37℃环境下静置处理10h，对消化后细胞采用无血清培养基配置成1×105/mL悬液，随后以100μL/孔密度进行接种，培养12h后将其中培养液弃去，添加存在10%胎牛血清培养基再次培养24h，在倒置显微镜下观察小管的形成。

1.3 观察指标

观察研究组和健康组孕妇外周血和脐血2-ME、胎盘组织COMT水平，分析外周血和脐血2-ME、胎盘组织COMT水平的相关性；分析不同浓度2-ME处理对hPMEC细胞增殖、迁移、小管新形成的影响。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 研究组与健康组孕妇外周血和脐血2-ME及胎盘组织COMT水平情况

研究组外周血2-ME水平显著低于健康组(P<0.05)，研究组与健康组脐血2-ME水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；研究组胎盘组织中COMT水平显著低于健康组(P<0.05)，见表1、图1。

表1 研究组与健康组外周血和脐血2-ME及胎盘组织COMT水平的比较Table 1 The comparison of 2-ME levels in peripheral blood and cord blood and COMT levels in placental tissue between the two

2.2 外周血和脐血2-ME及胎盘组织COMT间相关性的分析

经Pearson相关性分析显示，外周血2-ME与脐血2-ME、胎盘组织COMT均呈正相关(P<0.05)，脐血2-ME与胎盘组织COMT呈正相关(P<0.05)，见表2。

表2 外周血2-ME和脐血2-ME及胎盘组织COMT间的相关性Table 2 The correlation among peripheral blood 2-ME,cord blood 2-ME and COMT in placental tissue

2.3 不同浓度2-ME处理组对hPMEC增殖影响的分析

不同浓度2-ME处理组(5、10、15μmol/L)的hPMEC在24h和48h的细胞抑制率均显著低于空白对照组(F值分别为18.907、18.593，P<0.05)，且随着2-ME处理浓度的增加，24h和48h的细胞抑制率均逐渐下降(P<0.05)，见表3。

表3 不同浓度2-ME处理组对hPMEC增殖的影响Table 3 The effect of different concentrations of 2-ME on the proliferation of

2.4 不同浓度2-ME处理组对hPMEC迁移和血管内皮细胞小管形成度影响的分析

不同浓度2-ME处理组(5、10、15μmol/L)的hPMEC迁移细胞数目和血管内皮细胞小管形成度均显著高于空白对照组(F值分别为25.751、42.215，P<0.05)，且随着2-ME处理浓度的增加，迁移细胞数目和血管内皮细胞小管形成度均逐渐增加(P<0.05)，见表4。

表4 不同浓度2-ME处理组对hPMEC迁移和血管内皮细胞小管形成度的影响Table 4 The effect of different concentrations of 2-ME on hPMEC migration and endothelial cell tubule

3 讨论

3.1 2-ME在FGR发生中的作用

FGR是重要的妊娠并发症之一，在我国FGR发病率为3%～7%，FGR新生儿病死率高于正常新生儿的3～5倍，同时FGR新生儿近期与远期并发症发生风险也显著上升[7]。目前研究认为胎盘血管形成异常所致胎盘血氧缺乏为FGR发生的重要原因，2-ME作为雌二醇重要代谢产物之一，主要通过胎盘COMT甲基化而诱导形成，在促进血管形成、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡中发挥着重要作用[8]。本研究中，研究组外周血2-ME水平显著低于健康组，研究组与健康组脐血2-ME水平比较差异无统计学意义，研究组胎盘组织中COMT水平显著低于健康组，这些均显示2-ME及COMT在FGR中发挥重要作用，分析原因认为2-ME在缺氧情况下通过促进血管形成、诱导绒毛滋养细胞增殖等过程改善胎盘血液循环，进而影响胎儿生长[9]。COMT是诱导雌二醇转化为2-ME的重要降解酶，经由影响锰超氧化物歧化酶水平而使机体缺氧诱导因子1α水平保持稳定，使血管内皮细胞功能损伤，进而诱导FGR发生[10]。本研究中，研究组与健康组脐血2-ME水平差异不大，可能是因为母体2-ME不能有效地穿过胎盘屏障所致。本研究中对外周血和脐血2-ME及胎盘组织COMT间的关系探究显示，各指标均存在明显正相关关系，提示三指标可能共同介导了FGR发病，但其具体机制尚需进一步研究证实。

3.2 2-ME在胎盘组织血管内皮功能中的作用

研究显示雌二醇可以抑制Ang-2所致心血管不良反应，而2-ME作为雌二醇重要代谢产物，在影响心血管病变中发挥着重要作用[11]。另一项体外研究显示，2-ME通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶和核转录因子-κB信号通路抑制血管细胞粘附蛋白-1表达，从而阻止单核细胞与血管内皮细胞的粘附，显示2-ME可以有效改善内皮功能[12]。Zou等[13]应用颅内静脉高压大鼠模型及缺氧人脐静脉内皮细胞进行了体内与体外血管形成诱导实验，发现经2-ME处理可以有效抑制缺氧导致血管形成，其主要经p53表达上调及ID-1表达下调发挥作用。国外一项对大鼠的动物实验发现，经2-ME处理可以有效抑制慢性间歇缺氧大鼠肺血管形成，其主要经影响肺动脉平滑肌增殖、活性氧及细胞迁移等过程发挥抑制肺血管形成作用[14]。有研究表明，2-ME可以抑制多种肿瘤细胞增殖，且这种作用显示为浓度与时间依赖性[15]。多项研究显示，2-ME对于血管作用具有一定双面性，其在不同类型疾病中经由不同信号通路影响疾病发生与进展[16-17]。为进一步明确2-ME在胎盘血管形成中的作用，本研究选择hPMEC进行体外细胞实验，其结果显示，经2-ME处理可以有效地促进hPMEC增殖、迁移及血管内皮细胞小管形成，并上调Ang-2分泌，且这一趋势还会随着2-ME浓度的增加而加重，表明2-ME可以有效地促进hPMEC血管重塑，其可能经上调Ang-2水平发挥作用，分析原因可能为2-ME通过上调Ang-2水平促进滋养细胞增殖分化，进而促进胎盘血管形成。

综上所述，FGR患者体内2-ME水平异常，且与胎盘COMT水平变化有关，2-ME可能影响胎盘组织血管内皮功能及血管形成，进而介导FGR发生，其中是否存在其他因素影响尚需进一步研究证实。