支气管哮喘患儿血清骨膜蛋白、IL-13和miR-155水平相关性的研究

路黎娟，徐梅佳，董 焱，吕 伟，林 珍

(上海交通大学医学院附属第九人民医院儿科，上海 201999)

支气管哮喘属于多种炎性细胞参与介导的慢性呼吸道炎性疾病。以气道高反应性、气道慢性炎症为主要特征，不同程度的气促、喘息、咳嗽或胸闷为支气管哮喘的主要临床表现。支气管哮喘的发病机制尚不明晰，但以往认为其发生与多种免疫细胞及产生的细胞因子有关联。据流行病学调查显示，受环境恶化及遗传因素作用的影响，支气管哮喘发病率呈逐年上升趋势；同时其发病无特定年龄限制，且常于清晨及夜间发作[1-2]。近年来临床研究发现，支气管哮喘与免疫调节紊乱、炎症反应、感染等因素密切关联[3-4]。本文对127例支气管哮喘患儿的骨膜蛋白(Periostin)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)和微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)水平进行检测，并对其相关性进行研究。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至2020年1月在上海交通大学医学院附属第九人民医院门诊就诊的支气管哮喘患儿127例为研究对象(研究组)；选择同时间段在本院接受健康体检的儿童127例为健康志愿者(对照组)。

研究组：男66例，女61例；年龄为5～13岁；缓解期65例，急性期62例。对照组：男63例，女64例；年龄为3～15岁。两组的性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、膳食钙摄入量比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

纳入标准：所有患儿均符合中华医学会对支气管哮喘的诊断标准[5]。排除标准：①一般资料不全；②患有先天性心脏疾病或肝肾等重要脏器功能不全；③患有血液系统、免疫系统疾病；④合并其他哮喘样疾病或慢性肺疾病；⑤合并过敏性疾病。

本文研究内容均已告知患儿家属并知情同意，同时获得本院伦理委员会批准。

表1 两组一般资料的比较Table 1 Comparison of baseline data between the two

1.2 肺功能的检测

采用Master Screen肺功能仪对所有受检儿童进行肺功能检查。对每位受检者测量3次以上，保留3次最佳数值，取其平均值。主要测试参数：第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)，第1秒用力呼气量占用力肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in 1 second to forced vital capacity，FEV1/FVC%)，最大呼气50%流量(maximal expiratory flow at 50%，MEF50)。

1.3 方法

对所有受检儿童于接诊当日采集外周空腹静脉血5mL，要求血液标本无脂血和溶血，置于无抗凝剂试管中，室温下凝固，3 000r/min离心处理15min，分离上清，-70℃低温下保存待检。

1.3.1 酶联免疫吸附检测相关指标表达水平

取50mL碳酸盐缓冲液对抗原进行稀释，加盖处理，4℃冰箱内存放24h，第2天重复洗涤3次，抛干，将稀释液(pH值为7.4的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1mL放入酶标本空白孔、标准孔、待测样品孔内，同时放入阳性和阴性对照标本，42℃环境中存放1h，移除液体，3次洗涤后抛干，在每个孔中放Periostin、IL-13、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、γ-干扰素(interferon γ，IFN-γ)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白抗体0.1mL，存放1h，移除液体后进行3次洗涤并抛干，在每个孔中放入底物液(0.1mol/L的Na2HPO4，0.05mol/L的枸橼酸)，混匀后放入0.1mL邻苯二胺，进行20min遮光，再次将2mol/L的H2SO40.05mL放置在每个孔内，终止反应。在酶标仪下测定Periostin、IL-13、TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF具体数值，参照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 间接法检测免疫功能T淋巴细胞亚群水平

将待测空腹静脉血5mL/人传代到5孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的饱和湿度环境下培养1天、2天和3天，然后再加入0.25%胰蛋白酶进行消化，以2 000r/min离心5min收取细胞，收取细胞后使用PBS缓冲液洗涤3min，再重复洗涤2次，完成后以2 000r/min离心，收集细胞后加入1mL PI染液，一定要在避光的常温下放置1h后，使用PE荧光染色进行特异荧光标记，在鞘液包裹下高速流动，流动期间会发射出光子，用流式细胞仪检测T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.3 RT-PCR法检测miR-155表达水平

提取TTK细胞总RNA，对提取总RNA的纯度、含量进行检测，随后逆转，逆转录处理后获得cDNA，使用Primer 5.0软件设计引物，采用2-△△Ct方法计算，内参U6。设置反转录反应条件：25℃ 10min，40℃ 1h，85℃ 5min；设置扩增条件：94℃ 20s，72℃ 30s，60℃ 30s，35个循环，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的miR-155表达量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组儿童肺功能指标情况

与对照组相比，研究组的FEV1、FEV1/FVC%、MEF50水平均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组儿童肺功能指标的比较Table 2 Comparison of pulmonary function indicators between the two

2.2 两组儿童血清Periostin、IL-13和miR-155水平情况

与对照组相比，研究组的哮喘缓解期、哮喘急性期患儿的Periostin、IL-13、miR-155水平均显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组儿童血清Periostin、IL-13和miR-155水平的比较Table 3 Comparison of serum Periostin,IL-13 and miR-155 levels among the

2.3 两组儿童哮喘相关炎症因子水平情况

在对照组、研究组的哮喘缓解期和哮喘急性期患儿中，TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)；相比对照组，哮喘缓解期、哮喘急性期患儿TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(哮喘缓解期与对照组比较，t值分别为13.830、29.730、28.180、10.790，P<0.05；哮喘急性期与对照组比较，t值分别为39.140、26.420、29.540、19.170，P<0.05)；相比哮喘缓解期，哮喘急性期患儿TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(t值分别为14.270、15.970、13.510、11.160，P<0.05)，见表4。

表4 两组儿童哮喘相关炎症因子水平的比较Table 4 Comparison of the levels of inflammatory factors related to asthma among the

2.4 两组儿童免疫功能情况

在对照组、研究组的哮喘缓解期和哮喘急性期患儿中，CD3+、CD4+、CD8+水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)；相比对照组，哮喘缓解期、哮喘急性期患儿CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(哮喘缓解期与对照组比较，t值分别为12.400、21.480、9.374，P<0.05；哮喘急性期与对照组比较，t值分别为19.810、32.050、11.720，P<0.05)；与哮喘缓解期相比，哮喘急性期患儿CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(t值分别为6.001、8.246、2.039，P<0.05)，见表5。

表5 两组儿童免疫功能的比较Table 5 Comparison of immune functions among the

2.5 Periostin、IL-13和miR-155三者的相关性

采用Pearson进行相关性分析，Periostin与IL-13呈正相关(r=0.403，P=0.001)；Periostin与miR-155呈正相关(r=0.655，P=0.001)；IL-13与miR-155呈正相关(r=0.482，P=0.001)，见图1。

3 讨论

支气管哮喘属于慢性气道炎症疾病，以不同程度的咳嗽、气喘、胸闷为主要症状。临床研究表明，儿童机体器官及组织发育尚未成熟，肺泡较少、身体免疫力低下、呼吸道系统功能不全是导致其呼吸道细菌侵袭感染的主要原因[6]。近年来，随着我国对支气管哮喘研究的增多，发现其是由多种细胞和细胞组分参与的异质性疾病，多发于清晨或夜间；受环境、遗传、气候等多种因素影响，其发病率呈逐年上升趋势[7]。若不及时接受有效治疗，会引发呼吸衰竭，甚至死亡，对患者生命健康造成极大威胁。因此，准确有效地诊断对治疗及预后评估具有重要意义。

3.1 Periostin、IL-13和miR-155生物学特征及其在支气管哮喘发病中的作用

本研究显示，急性期支气管哮喘患儿Periostin、IL-13、miR-155水平均显著高于健康儿童和缓解期患儿，提示Periostin、IL-13、miR-155均参与了哮喘的发生、发展过程。Periostin属于细胞基质蛋白，于细胞表面与数种整合素分子相互作用，为组织生长、重构提供了条件[8]。相关研究显示，在气道上皮细胞中，Periostin蛋白通过促进纤维母细胞趋化因子生成，加剧患者肺部炎症；同时，Periostin具有自分泌效应，通过调节相关细胞水平，在气道纤维化过程中发挥作用，其是哮喘发病的作用机理[9]。IL-13主要由Th2细胞分泌，是重要的炎症因子，具有多种效能。相关研究显示，气道的免疫调节和炎症与IL-13有关联，可单独介导引起哮喘；同时，IL-13可对纤维细胞产生刺激，使其活化参与气道重塑[10]。miRNA对临床多种病理、生理的生物学改变具有调控作用，其表达水平能够对多种疾病的发病情况做出相对反映。miR-155在T细胞分化过程中具有关键意义。在机体正常情况下，miR-155水平较为平稳，当机体发生疾病时，其水平呈异常高表达，因此，通过miR-155水平的检测能够对疾病严重程度做出直观评估。本研究显示，Periostin、IL-13、miR-155在支气管哮喘中表达均较高，且其表达水平在急性期中均明显高于缓解期。由此证实，Periostin、IL-13、miR-155与支气管哮喘发生存在必要关联，且其水平变化受病情程度影响，因此可通过对其水平的检测有效评估病情，临床应用价值较高。

3.2 炎症因子在支气管哮喘发病中的作用

本研究显示，支气管哮喘患儿血清TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均高于健康儿童，IFN-γ、CD8+、CD3+、CD4+水平均低于健康儿童，说明支气管哮喘的发生与机体炎症反应、免疫功能存在关联。气道重塑与气道炎症是支气管哮喘中最常见的病理变化。研究显示，TGF-β1作为强烈致纤维化作用因子，是气道重塑的实质，可有效刺激气道平滑肌细胞[11]。IFN-γ对细胞免疫反应具有介导作用，能够减轻哮喘气道炎症。相关研究表明，肺组织缺氧导致HIF-1α降解减少和转录增加，造成气道痉挛、气管壁平滑肌细胞机械张力增加[12]。VEGF作为血管新生正调控因子，对血管内皮细胞增殖具有促进作用，同时对血管通透性的增加具有促进效果，在呼吸道炎症和重塑中发挥重要作用。T淋巴细胞亚群作为临床常用免疫检测指标，其水平变化显示患者机体免疫情况。CD3+能够反映机体免疫能力，其高表达表示机体免疫能力增强；CD4+对细胞炎症反应具有刺激或介导作用；CD8+属于细胞毒性T细胞[13]。本研究显示，支气管哮喘患儿机体炎症反应明显高于健康者，免疫功能较低，同时通过对不同程度病情观察发现，机体炎症反应状态随病情发展而升高，机体免疫能力随病情发展而降低，提示炎症因子在支气管哮喘病情进展中发挥重要作用，并对机体免疫能力造成影响。

综上所述，检测Periostin、IL-13、miR-155水平对支气管哮喘患儿的诊断及预后具有重要意义，且其水平在支气管哮喘中具有一定的相关性，可为支气管哮喘临床诊断提供一定参考依据。