BDNF对过敏性哮喘小鼠气道炎症影响的研究

聂 颖，张领领，胡军峰，徐辉甫

(武汉市第一医院儿科，湖北 武汉 430022)

支气管哮喘(哮喘)是儿童中常见的慢性肺部疾病，儿童哮喘因病情反复发作、迁延不愈等特点，对其身心健康及家庭和社会带来了巨大的经济、精神负担[1]。目前全球约有3亿哮喘患者，其中儿童发病率约占总发病率的一半[2]。中国16城市儿童哮喘患病率20年对比研究显示，0～14岁中国儿童哮喘的总患病率较10年及20年前分别上升了43.4%和147.9%[3]。近年来，脑源性神经生长因子(brain-derived neurotropic factors，BDNF)参与哮喘气道炎症反应的过程日益受到关注。临床研究表明，BDNF不仅参与了儿童哮喘的发病，且与儿童哮喘发病的严重程度呈正相关，但其具体机制尚不明确[4-5]。本研究通过建立过敏性哮喘小鼠模型，运用重组人BDNF及其抑制剂TrkB/Fc对哮喘模型进行干预，观察干预肺组织中BDNF表达的变化及气道炎症、炎症相关因子白细胞介素-17A(IL-17A)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)表达的变化情况，探讨BDNF参与哮喘气道炎症的分子机制，为儿童哮喘的病情评估及精准治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及实验动物

1.1.1 主要材料

鸡卵清蛋白(ovlbumin，OVA，Sigma公司)，重组人BDNF(美国PeproTech)，TrkB/Fc(美国R&D公司)；一抗：Anti-BDNF(美国Abcam公司)；二抗：山羊抗兔辣根过氧化物酶(美国Santa Cruz公司)；小鼠IL-17A ELISA试剂盒(美国R&D公司)、小鼠Eotaxin ELISA试剂盒(美国R&D公司)。

1.1.2 实验动物

经过伦理委员会批准，选取2019年10月至12月饲养于武汉市第一医院SPF级实验动物中心的雌性3～4周龄C57/B6J小鼠40只，体重10～12g。该实验获武汉市第一医院动物保护和利用委员会批准。动物饲养稳定于约25℃，相对湿度约70%，昼夜照明12/12h。

1.2 实验方法

1.2.1 哮喘模型的建立

依据有关参考文献[6]建立哮喘小鼠动物模型。哮喘组小鼠于第1、13天经其腹腔注射0.01%OVA/A1(OH)3，混合液0.1mL[内含OVA 10μg和A1(OH)3凝胶20mg]致敏，从第25天开始，每天以1%OVA生理盐水溶液雾化激发30min，连续7天。正常对照组小鼠致敏及激发时均以生理盐水替代OVA。

1.2.2 实验动物的分组及药物的干预

以随机数字表法将实验动物分为五组，每组8只，分别为A组：正常对照组；B1组：哮喘组(模型未干预组)；B2组：哮喘+生理盐水干预组；B3组：哮喘+重组人BDNF干预组；B4组：哮喘+TrkB/Fc干预组。模型激发的第25天开始，激发前1h将各干预组小鼠以10%水合氯醛4mL/kg腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤行气道插管，将2μg/小鼠的重组人BDNF或1μg/小鼠的TrkB/Fc溶解于50μL的0.9%氯化钠中，气道内滴注给药，连续7天，每日1次。

1.2.3 HE染色及肺组织的病理评分

石蜡切片二甲苯脱蜡，酒精脱水，置于HE染色5min，酒精分化10s，流水冲洗返蓝20min，HE染色20s，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察。

肺组织的病理评分参照Lee等[7]的评分标准，支气管周围炎症细胞浸润程度判定：0分为没有炎症细胞；1分为可偶见炎症细胞；2分为可见薄层(1～5个)炎症细胞；3分为可见厚层(>5个)炎症细胞。

1.2.4 Western blot法检测肺组织中BDNF蛋白的表达

肺组织50mg置于匀浆管中加入组织裂解液500μL裂解30min，提取蛋白并调整蛋白浓度。样品加热变性后电泳转至聚偏二乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉TTBS缓冲液室温振荡封闭2h后洗膜，加入一抗羊抗鼠BDNF单克隆抗体(1∶1 000，Abcam公司)4℃室温孵育过夜，第2天加入二抗辣根酶标记羊抗兔(1:5 000，Santa Cruz公司)室温孵育1h，小鼠β-actin作内参照，用LAS3000图像分析系统，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值进行定量分析。

1.2.5 ELISA法检测肺组织中IL-17A、Eotaxin水平

采用ELISA法检测IL-17A、Eotaxin水平，严格按照试剂盒说明书进行具体操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理学形态改变及肺组织的病理评分

2.1.1 肺组织的病理改变

正常对照组(A组)小鼠细支气管和肺泡壁结构清晰，无炎症细胞浸润；哮喘组(B1组)小鼠细支气管周围可见大量炎症细胞浸润，基底膜增厚；哮喘+生理盐水干预组(B2组)小鼠细支气管周围可见大量炎症细胞浸润，上皮细胞增生，肺泡间隔增宽；哮喘+重组人BDNF干预组(B3组)小鼠细支气管周围可见大量炎症细胞浸润，黏液分泌增多、管腔狭窄，平滑肌层、基底层增厚，较B1组、B2组炎症细胞浸润情况明显加重；哮喘+TrkB/Fc干预组(B4组)小鼠细支气管周围可见炎症细胞浸润，较B1组明显减轻，见图1。

2.1.2 肺组织的病理评分

五组的肺组织病理评分比较差异有统计学意义(P<0.01)；B1、B2、B3、B4组的病理评分均显著高于A组(P<0.01)；B2组与B1组病理评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，B3组病理评分显著高于B1组(P<0.01)，B4组病理评分显著低于B1组(P<0.01)；B3组病理评分显著高于B2组(P<0.01)，B4组病理评分显著低于B2组(P<0.01)；B4组病理评分显著低于B3组(P<0.01)，见表1。

表1 各组小鼠肺组织的病理评分的比较Table 1 Comparison of pathological score of lung tissues of the mice among the five groups

2.2 各组小鼠肺组织中BDNF蛋白的表达

应用Western blot法检测蛋白的表达，五组的肺组织中BDNF蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.01)；B1、B2、B3组的BDNF蛋白表达均高于A组(P<0.01)，B4组与A组BDNF蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；B2组与B1组BDNF蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，B3组BDNF蛋白表达显著高于B1组(P<0.05)，B4组BDNF蛋白表达显著低于B1组(P<0.01)；B3组BDNF蛋白表达显著高于B2组(P<0.01)，B4组BDNF蛋白表达显著低于B2组(P<0.01)；B4组BDNF蛋白表达显著低于B3组(P<0.01)，见图2、表2。

表2 各组小鼠肺组织BDNF蛋白表达的比较Table 2 Comparison of expression level of BDNF protein in lung tissues of the mice among the five groups

2.3 各组小鼠肺组织中IL-17A和Eotaxin水平的表达

2.3.1 各组小鼠肺组织中IL-17A水平的表达

应用ELISA法检测IL-17A水平，五组的IL-17A水平比较差异有统计学意义(P<0.01)；B1、B2、B3、B4组的IL-17A水平均显著高于A组(P<0.01)；B2组与B1组IL-17A水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，B3组IL-17A水平显著高于B1组(P<0.01)，B4组IL-17A水平显著低于B1组(P<0.05)；B3组IL-17A水平显著高于B2组(P<0.01)，B4组IL-17A水平显著低于B2组(P<0.01)；B4组IL-17A水平显著低于B3组(P<0.01)，见表3。

表3 各组小鼠肺组织中IL-17A水平的比较Table 3 Comparison of IL-17 level in lung tissues of the mice among the five groups

2.3.2 各组小鼠肺组织中Eotaxin水平的表达

应用ELISA法检测Eotaxin水平，五组的Eotaxin水平比较差异有统计学意义(P<0.01)；B1、B2、B3、B4组的Eotaxin水平均显著高于A组(P<0.01)；B2组与B1组Eotaxin水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，B3组Eotaxin水平显著高于B1组(P<0.01)，B4组Eotaxin水平显著低于B1组(P<0.01)；B3组Eotaxin水平显著高于B2组(P<0.01)，B4组Eotaxin水平显著低于B2组(P<0.01)；B4组Eotaxin水平显著低于B3组(P<0.01)，见表4。

表4 各组小鼠肺组织中Eotaxin水平的比较Table 4 Comparison of Eotaxin level in lung tissues of the mice among the five groups

3 讨论

3.1 BDNF促进儿童哮喘气道炎症的发生

冯帅等[8]研究表明，BDNF Val66Met基因多态性(Val/Val、Met/Met)在哮喘患儿中显著升高，说明功能性BDNF的多态性(rs6265)与儿童哮喘呈正相关，且助于儿童严重哮喘的形成。本研究发现，哮喘小鼠肺组织中BDNF呈过表达状态(P<0.01)；同时运用重组人BDNF或其抑制剂TrkB/Fc对模型进行干预发现，哮喘+重组人BDNF干预组肺组织中炎症细胞浸润较哮喘组明显加重，而哮喘+TrkB/Fc干预组肺组织中炎症细胞浸润较哮喘组明显减轻，说明BNDF参与哮喘气道炎症的发生过程，BDNF高表达可诱导、趋化气道炎症因子的释放。Freeman等[9]研究显示，在人类气道平滑肌细胞(ASM)中存在通过囊泡自分泌BDNF，其通过对受体电位3(TRPC3)通道的调节，使Ca2+内流增加气道张力及促进气道炎性因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放。Müller等[10]对6～15岁哮喘持续期患儿的血浆BDNF水平和各种炎症标志物(CCL3、CCL11、CCL22、CCL24等)进行检测发现，中、重度哮喘患儿BDNF水平显著增高，而其他各种炎症标志物与对照组均无差异，提示BDNF是一种潜在的哮喘患儿临床严重程度的生物标志物。由此提示BDNF参与了儿童哮喘气道炎症的发生，在哮喘的发病过程中起促进作用。故本研究通过BDNF对哮喘小鼠进行干预，以气道炎症为切入点，了解其下游气道炎症介质的变化，进一步明确其分子机制，为儿童哮喘的诊断、预防及治疗提供新的思路。

3.2 BDNF介导气道炎症因子IL-17A和Eotaxin的释放促进气道炎症的发生

本研究显示，与正常对照组比较，哮喘小鼠的气道炎症因子IL-17A、Eotaxin均呈高表达(P<0.01)；而哮喘+重组人BDNF干预组中IL-17A、Eotaxin的表达均较哮喘组显著升高(P<0.01)，哮喘+TrkB/Fc干预组中IL-17A、Eotaxin的表达均显著低于哮喘组(P<0.05)。IL-17通常是指IL-17A，是IL-17家族中最先被发现的细胞因子，是Th1细胞重要的效应因子；IL-17A通过参与炎症反应和宿主抗感染免疫，直接或间接地参与了哮喘的病理生理过程[11]。在儿童哮喘发作期，患儿血清中IL-17表达显著增高，且经治疗后IL-17表达显著下降，故IL-17参与了哮喘的发病，且与儿童哮喘病情严重程度正相关[12-13]。在幼年哮喘大鼠模型中，IL-17可通过诱导CCL4、CXCL1、GM-CSF等细胞因子的表达，促进炎性因子的激活和炎性细胞向气道的浸润，由此提示IL-17在儿童哮喘气道炎症中发挥着重要作用[14]。研究表明，嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)浸润是哮喘发生的中心环节，在学龄期哮喘患儿急性发作组、慢性持续组和缓解组血中EOS均显著升高，且与哮喘患儿肺功能呈负相关[15]。Eotaxin是一种β-趋化因子，能特异性地募集、趋化和活化EOS，在哮喘患儿中显著增高，与其疾病严重程度正相关[16]。Eotaxin通过特异性地与EOS上高表达的Eotaxin特异性受体C-C趋化因子受体-3(C-CR3)结合，激活分裂素活化蛋白(MAP)激酶，细胞外信号调节激酶-2(ERK2)和p38，使EOS聚集浸润，导致气道上皮细胞活化、炎症介质释放而引起气道炎症及气道高反应[17]。结合本研究通过重组人BDNF或其抑制剂TrkB/Fc对哮喘模型进行干预，发现BDNF可促进哮喘气道炎症的发生，同时对肺组织细胞因子IL-17A、Eotaxin起正性调节作用，由此提示BDNF可能通过促进气道炎症因子IL-17A、Eotaxin的释放而参与儿童哮喘的发病过程。

3.3 IL-17A和Eotaxin参与气道炎症的可能机制及进一步的研究方向

IL-17A与IL-17R复合物结合后可引起气道上皮细胞、细胞内皮细胞及成纤维细胞中的IL-1β、IL-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增加，促使中性粒细胞的聚集而参与哮喘的发生[18]。本研究发现，在BDNF干预下，IL-17A和Eotaxin的表达均显著升高，由此推测，在过敏性哮喘小鼠模型中，BDNF作用于模型后可上调小鼠气道IL-17A的分泌增多，诱导相关炎症因子Eotaxin的表达，使EOS活化、聚集而参与哮喘气道炎症的发生。IL-17A、Eotaxin均与儿童哮喘发作密切相关，且与儿童哮喘疾病严重程度呈正相关，而本研究显示在哮喘小鼠中IL-17A和Eotaxin呈同步升高，具有一定的关联性，因此可进一步研究其在幼年哮喘小鼠中的作用机制，为儿童哮喘的评估及治疗提供新的思路。