红外光谱结合化学计量学快速检测熊胆粉真伪及掺伪问题

袁明昊，周 涛，钟文潇，周 强，雷苛露，曾大富，李建刚，郭 力*

1成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室；2成都晶博生物科技有限责任公司，成都 611137

熊胆粉为熊科动物黑熊SelenaretosthibetanusCuvies经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，具有清热、平肝、明目的功效[1]，为我国四大名贵动物药材之一。由于熊胆粉来源特殊价格昂贵，市场上存在以其他动物胆粉冒充熊胆粉进行销售的情况。此外，本课题组前期市场调研发现由于猪胆粉和牛胆粉产量可观价格低廉，外观性状与熊胆粉较为相似，除作为伪品冒充熊胆粉外，还常掺入熊胆粉中出售，且与伪品相比，掺伪品的检测难度更高。此类现象导致市售熊胆粉质量参差不齐，严重影响临床疗效和消费者权益，因此，熊胆粉的真伪鉴别及掺伪比例预测对于熊胆粉的质量控制具有重要意义。

熊胆粉常用鉴别方法包括薄层色谱法[2]、高效液相色谱法[3]及特异性聚合酶链式反应(PCR)[4]，但此类方法存在耗时较长、操作复杂、对样本有破坏性等问题，且在样本量较大的情况下部分方法耗费大量有机试剂。近红外光谱具有分析速度快、对样本破坏性小、无需预处理等优点，现已广泛应用于中药的真伪和掺伪鉴别[5]。然而由于熊胆粉具有强烈的吸湿性，用于近红外光谱分析后易损失部分样品，因此该方法应用于胆类药材具有一定的局限性。与近红外光谱相比，红外光谱法同样具有分析快速、灵敏等特点，且所需样本量极少，更适用于贵重药材的质量控制。目前采用红外光谱法鉴别熊胆粉的报道较少，仅Yan等[6]对比了熊胆粉与其余3种动物胆粉的红外光谱，但其样本量较少，对掺伪行为缺乏关注且未结合化学计量学对结果可视化。本研究以熊胆粉与猪胆粉、牛胆粉制备了不同比例的掺伪样品，采集了正品、7类伪品及2类掺伪品的红外光谱，采用基线校正、平滑、求导等预处理方法对所得光谱进行优化，结合正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和偏最小二乘回归(PLSR)方法，探究红外光谱用于熊胆粉真伪鉴别及掺伪比例预测的可行性，为熊胆粉及其他贵重药材的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

傅里叶变换红外光谱(PerkinElmer)；YP-2压片机(上海山岳科学仪器有限公司)。

1.2 样品与试剂

1.2.1 正品熊胆粉

供试熊胆粉共94批，由成都晶博生物科技有限公司提供，经成都中医药大学龙飞副教授鉴定为中药熊胆粉正品。样品研碎过80目筛后置干燥器中保存备用。

1.2.2 伪品及掺伪品

猪胆粉、牛胆粉、羊胆粉、兔胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉和鹅胆粉各10批由实验室自制，新鲜胆汁过滤后50 ℃鼓风干燥，研碎过80目筛即得。将猪胆粉和牛胆粉分别按照不同的比例(W/W)掺入10批正品熊胆粉中，共得180批掺伪熊胆粉(猪胆粉掺伪、牛胆粉掺伪各90批)，其中猪胆粉掺伪比例为7.92%～91.84%，牛胆粉掺伪比例为8.08%～94.24%。

1.2.3 试剂

光谱级溴化钾购于成都市科隆化学品有限公司。

1.3 压片及样品测定

取供试品粉末约1.0 mg，加入150 mg溴化钾粉末，置玛瑙研钵中研细并混合均匀，随后置压片模具中于压片机上压片2 min，取出置透射测定架并采集其红外光谱。

以空白溴化钾为背景，光谱采集范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数为32次。

1.4 光谱预处理

采用OMNIC 9.2软件对光谱数据进行自动基线校正、平滑、标准正态变量变换(SNV)及求导后导出数据为CSV格式，采用Origin 2021软件绘制红外图谱，使用SIMCA 14.1软件建立OPLS-DA模型，使用The Unscrambler X 10.4软件建立PLSR模型。

1.5 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是在偏最小二乘判别(PLS-DA)基础上发展的一类有监督的学习方法，与PLS-DA相比，OPLS-DA将X变量中的系统变异分解为同Y变量线性相关和同Y变量正交的部分，随着正交变异组分增加将提供更多的解释性[7]。OPLS-DA模型的优劣通过内部验证、置换验证及外部验证进行评价。一般情况下，内部验证中模型对变量解释度R2和预测度Q2越接近1，且R2和Q2差距不大于0.2～0.3，则模型越可靠。置换验证中所有样品对应R2和Q2计算值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距应分别小于0.3和0.05。外部验证中预测准确率越高则模型越可靠[8]。

1.6 偏最小二乘回归(PLSR)

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

8种动物胆粉的红外光谱图经自动基线校正及平滑预处理后如图1所示，熊胆粉的主要吸收峰位于3 430、2 925、2 860、1 650、1 550、1 200、1 050 cm-1等处，其中3 430 cm-1处宽峰为-OH和-NH基团的伸缩振动；2 925和2 860 cm-1处为烷烃C-H的伸缩振动；1 650和1 550 cm-1处分别为-CO伸缩振动以及N-H的弯曲振动，二者为酰胺基特征吸收峰；1 200和1 050 cm-1处的双强峰为-SO3H的特征吸收峰[13]。大部分伪品吸收峰波段与熊胆粉较为相似但吸收强度不同，其中磺酸基的吸收峰强度差异最为显著。此外，仅牛胆粉和羊胆粉红外光谱图中1 000～900 cm-1波段表现出胆酸吸收峰[14]。动物胆粉中主要化学成分为胆汁酸且以结合型胆汁酸为主，红外光谱反映了此类化合物酰胺基和磺酸基等多种化学键信息，为利用红外光谱鉴别熊胆粉真伪及预测掺伪比例提供了理论依据。

图1 熊胆粉及其伪品红外图谱

2.2 熊胆粉正品、伪品及掺伪品的鉴别分析

2.2.1 样本集划分

采用SPSS 25将正品、伪品及掺伪品按4∶1比例进行随机样本集划分，其中正品、伪品及掺伪品校正集样本分别为75、56和144份，验证集样本分别为19、14和36份。累计获得校正集275份，验证集69份。

2.2.2 预处理方法选择

在红外光谱采集过程中，样品制备过程及外界环境均会对光谱数据产生一定的影响，因此，在建立红外模型之前需对红外光谱进行预处理。本课题组前期研究发现样本的红外光谱基线漂移严重，在不对其进行基线校正的情况下观察到明显的组内差异，后续无论何种预处理方法均无法改善此类情况。因此，所有原始光谱均经自动基线校正(Baseline)及平滑(SG-Smoothing)之后进行后续预处理。红外光谱常用的预处理方法包括标准正态变量变换(SNV)、一阶求导(1st D)和二阶求导(2nd D)等。SNV可消除样本颗粒分布不均匀对光谱的散射影响，而求导可提高光谱分辨率和灵敏度[15]。不同光谱预处理方法建立的熊胆粉正品、伪品及掺伪品的OPLS-DA模型参数见表1。结果表明，经SNV + 2nd D预处理后模型性能最佳，校正集和验证集预测准确率均高于95%。该模型最佳主成分个数为2，累计解释了86.26%的总方差。

表1 不同光谱预处理方法建立的熊胆粉-掺伪品-伪品样本判别模型性能

2.2.3 熊胆粉正品、伪品及掺伪品判别分析模型的建立与验证

如图2所示，熊胆粉正品、伪品和掺伪品具有各自的空间分布，由于伪品中包含多种其他动物胆粉，因此该分组中部分样本分布较为离散。校正集中仅有1个猪胆粉样本被误判为掺伪品，验证集中有一个熊胆粉正品样本和牛胆粉样本被误判为掺伪品。对模型进行置换验证结果模型中所有样品对应R2和Q2计算值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.162和-0.267，表明该模型没有过拟合。

图2 正品、伪品和掺伪品得分图

为验证模型的预测能力，使用模型外的5批熊胆粉、10批掺伪熊胆粉(不同比例掺伪猪胆粉及牛胆粉各5批)和25批伪品(猪胆粉和牛胆粉各5批，其余动物胆粉各3批)进行外部验证。将以上外部验证样本代入已建立的OPLS-DA模型，模型判别准确率为100%，表明该模型具有良好的预测能力，可用于鉴别熊胆粉真伪及掺伪行为。

2.2.4 伪品来源判别模型的建立与验证

同“2.2.1”项下样本集划分方法，所有伪品胆粉红外光谱经预处理后建立了OPLS-DA模型用以区分伪品胆粉来源，最佳预处理方法为SNV + 2nd D。该模型最佳主成分个数为6，R2= 0.970，Q2= 0.957，校正集和验证集预测准确率均为100%，基于前2个主成分的2D得分图如图3所示。置换验证中中所有样品对应R2和Q2计算值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.136和-0.384，证明该模型没有过拟合。所有外验证样本均被正确判别，表明该方法可在区分熊胆粉真伪的基础上进一步鉴别伪品来源。

图3 不同伪品得分图

2.2.5 不同类别掺伪熊胆粉判别模型的建立及验证

同“2.2.1”项下样本集划分方法，将所有掺伪熊胆粉样本划分为训练集与验证集。掺伪品类别鉴定的OPLS-DA模型最佳光谱预处理方法为SNV + 1st D，该模型最佳主成分个数为8，R2= 0.923，Q2= 0.868，校正集和预测集准确率分别为100%和97.22%，其2D得分图如图4所示。置换验证中中所有样品对应R2和Q2计算值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.205和-0.410，表明该模型没有过拟合。将10批未参与建模的掺伪熊胆粉样本代入模型进行外部验证，结果准确率为100%。上述结果表明，红外光谱结合化学计量学可鉴别熊胆粉正品、伪品及掺伪品并可进一步区分掺伪品类别。

图4 不同类型掺伪品的得分图

2.3 熊胆粉掺伪比例定量分析

2.3.1 样本集划分

同“2.2.1”项下样本集划分方法，将2种掺伪熊胆粉样本分别进行样本集划分，各自得到72个校正集和18个验证集样本。

2.3.2 预处理方法选择

表2 不同光谱预处理对不同类别掺伪熊胆粉的定量分析模型校正和预测结果的影响

2.3.3 最佳因子数的选择

图5 PLSR模型中不同因子数的预测残差平方和与验证集R2

2.3.4 掺伪熊胆粉定量校正模型的建立与评价

图6 熊胆粉掺伪比例模型的预测值与实际值

2.3.5 定量校正模型的外部验证

选择未参与建模的5批猪胆粉和牛胆粉样品与熊胆粉按不同比例混合，将采集的红外光谱输入已建立的PLSR模型进行外部验证。预测回收率为外部验证样本的模型预测值与实际值之比，结果见表3。熊胆粉掺伪猪胆粉的模型预测值和真实值相对误差为2.64%～9.61%，平均回收率为104.81%；熊胆粉掺伪牛胆粉的模型预测值和真实值相对误差为2.51%～8.87%，平均回收率为100.11%。以2种掺伪样本的模型预测值与真实值分别进行配对t检验，结果P值均大于0.05，表明模型预测值与实际值无显著性差异，通过红外光谱结合PLSR可实现对以上两种掺伪物掺伪比例的快速预测。

表3 外部验证样本预测结果

3 讨论与结论

与目前动物胆类药材常规分析方法相比，红外光谱法在保证结果准确性的同时节省了时间与成本，以近乎无损的方式完成了对贵重药材的质量控制。根据目前本课题组收集样本所建立的熊胆粉定性及定量模型，红外光谱法展现出了优异的检测能力，但光谱模型建立在大量样本的基础上且需不断补充样本以提高模型准确性及稳定性，因此后续将进一步增加样本类别及数目，更为准确地评价熊胆粉质量。

随着化学计量学的发展，红外光谱在药材质量控制方面具有广泛的应用前景，本研究为贵重药材质量控制提供了一个简单快捷的新方法，也为熊胆粉的质量控制提供了参考依据。