中药中寡糖分离分析方法研究进展

刘妍妍，刘建飞，邢连喜，邸多隆*

1甘肃中医药大学药学院；2中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室，兰州 730000；3西北大学生命科学学院，西安 710069；4陕西功能食品工程中心有限公司，西安710000

随着2012年糖科学领域路线图[1]的绘制，该领域已经成为生命科学的前沿。越来越多的科学家认识到多糖作为生命过程中不可或缺的信息和功能分子，在细胞的生长、分化、发育过程中担任着关键角色。美国功能性糖组学国际联合会(Consortion of Function Glycomics，CFG)向美国国立卫生研究院汇报其研究成果时指出，动物、植物和微生物中糖链结构与功能研究是未来糖生物学研究的重要方向，必将为人类疾病的研究和治疗带来新的希望。2018年由中国海洋大学、中国科学院上海药物研究所和上海绿谷制药联合研发的治疗阿尔茨海默症新药“甘露寡糖二酸(GV-971)”以其新颖的作用模式与独特的多靶点作用特征，为阿尔茨海默症药物研发开辟了新路径，并有望引领糖类药物研发新的浪潮[1]。GV-971的成功研发使人们更加清晰地认识到糖类正在改变人类对生命现象和疾病的认识。糖链结构复杂功能多样，契合复杂疾病治疗的标准需求，糖类药物有望引领治疗复杂疾病的创新前沿[2]。寡糖也是糖类研究的一个重要组成部分，寡糖是2～10个相同或不同的单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的一类碳水化合物，构成单元主要为五碳或六碳糖，以葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)和甘露糖(mannose)等最为常见。现代研究表明：寡糖具有降血糖[3,4]、抗创伤后应激障碍[5]、抗肿瘤[6,7]、抗菌[8]、免疫增强[9-11]、调节肠道菌群[12]、抗抑郁[13]、增强造血功能[14]、抗病毒[15]等多种药理、生理活性。从中药资源种类多样性和其潜在的药理活性而言，中药寡糖的研究具有重大意义和发展前景。该篇内容综述了中药寡糖在提取纯化、分离分析、结构鉴定三个方面的研究进展，以期为寡糖的现代药物研究和临床应用以及功效产品创制提供科学参考。

1 中药寡糖提取方法研究进展

寡糖多为水溶性糖，通常采用水提法、水提醇沉法、回流提取法、超声提取法、微波提取法、酶解法或多种方法联用的方式来提取。巴戟天低聚糖是一种较为常见的中药寡糖，一般采用水提法进行提取，但由于中药提取液中除含有低聚糖外，还含有部分多糖及蛋白质，因此采用水提法需要加入乙醇沉淀多糖；另一种提取方法为回流提取法，利用寡糖易溶于乙醇而多糖、可溶性蛋白质不溶于乙醇的性质，采用乙醇为提取溶剂可得到纯度更高的寡糖并简化操作步骤；采用乙醇提取的另一原因是巴戟天低聚糖在水中不稳定，在不同pH水溶液中提取变化差异较大，低聚糖会被水解或者产生较多新的未知成分，而低聚糖在乙醇体积分数为40%或以上时的溶媒中较为稳定[16]，因此40%乙醇经常被用作巴戟天寡糖的提取溶剂。

Zhou等[17]以95%乙醇为提取溶剂对桂花寡糖进行提取，在最优条件下，桂花寡糖的提取率为90.29%。该方法操作简便、精密度高，且桂花寡糖的收率稳定。Ma等[18]用水提醇沉法制得4个不同产地的粗党参低聚糖，经Sephadex G-25纯化得到精制的党参低聚糖，其中山西产党参提取率为34%、甘肃产党参1号和素花党参为16%，四川产党参为13%。Liu等[19]使用超声波辅助提取山药低聚糖，得率提高了3.91%。Norazlina等[20]采用微波辅助法从柠檬草叶片中提取木糖，提取率可达到2.91 g/L。Guo等[21]采用超声-微波辅助提取法优化了莲子低聚糖的提取工艺，莲子低聚糖提取10 min时，最高得率可达10.53%，而用热水浸提法提取莲子低聚糖时间为66 min，得率仅为8.09%[22]；Deng等[23]通过酶解来提高琼胶寡糖水解度，得到新琼四糖和少量新琼二糖，还原糖含量为4.652 mg/mL，这说明酶解反应不仅可以得到某一特定聚合度的寡糖，还可通过控制酶解程度，同时得到多个聚合度的寡糖，该工作为功能性琼胶寡糖的酶解制备和应用提供科学参考。Zhao等[24]探索了酶法和超声提取法联用提取灵芝寡糖的最佳工艺，先探索了最佳酶解条件，然后利用超声处理酶解后的样液，优化超声条件，在最佳优化条件下灵芝寡糖最高得率为61.64%，比原料液中提高了1.76%，因此就寡糖产量而言，该方法可以作为寡糖提取的一种有效方案。与巴戟天寡糖相同，石莼可溶性糖粗提液中也夹杂许多的多糖及可溶性蛋白质，Li[25]采用超声辅助酶法先对寡糖进行提取，对提取液进行浓缩后采用醇沉法去除多糖和蛋白质，得到石莼功能性寡糖，提取率为2.38%。

以上内容表明，寡糖的提取正在从传统的高料液比、长时间、操作复杂及低效率向低料液比、短时间、操作简单及多种提取方法的联用进行转变，与传统方法相比，寡糖的提取效率、提取纯度也有明显提高。寡糖提取方法比较见表1。

表1 寡糖提取方法比较

2 中药寡糖分离方法研究进展

寡糖的分离方法主要有膜分离法、液相色谱法和毛细管电泳法等。寡糖分离方法总结见表2。

表2 寡糖分离方法总结

2.1 膜分离技术

膜分离技术是利用机械筛分的原理选择性从溶液中分离目标物质的方法，具有不损害样品生物活性、分离效率高、能耗低、无污染等优点，被广泛应用于中药寡糖的分离。Zhao等[26]采用纳滤膜NF-3A、NF-2A构建了恒容渗滤方法分离纯化大豆低聚糖发酵液，收率可达83.2%，纯度可达77.9%。Cai等[27]采用微滤、超滤、纳滤膜建立了整合集成膜分离系统，利用该系统从猴头菌中分离得到粗寡糖，含量为14.84%，纯度为63.71%。Nabarlatz等[28]采用商业薄膜聚合超滤膜纯化杏仁壳水解得到的低聚木糖，占回收非挥发性产物的58.3%。用膜过滤技术分离寡糖时，要根据目标分离物的分子大小选择适宜孔径的滤膜，孔径大的微滤只是简单的粗过滤，过滤精度较低；超滤法一般被用来除蛋白质或其他大分子物质，而纳滤膜可除去一些小分子糖类。膜分离法分离寡糖收率较高，而且可获得纯度较高的寡糖，但该方法不适合分离分子量相近的寡糖。同时，该技术对设备要求和膜的要求较高，操作复杂，还受到压力、温度、时间等多种因素的影响。

2.2 液相色谱法及其联用技术

液相色谱法是寡糖分离分析应用最广泛的方法，根据所选色谱柱的不同可具体划分为凝胶排阻色谱法、亲水作用色谱法、阴离子交换色谱法、石墨化碳柱色谱法、反相高效液相色谱法等。

2.2.1 凝胶色谱法(gel chromatography，GFC)

凝胶色谱法是根据被分离化合物的分子大小不同实现分离，分子量小的可以进入材料的孔隙，因此保留时间较长，最后被洗脱出来；而分子量大的化合物则与之恰好相反。凝胶色谱法按照流动相的不同又分为凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography，GFC)和凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，GPC)。寡糖分离最常用的色谱填料有葡聚糖凝胶G(Sephadex G)、羟丙基葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio gel P)。Pan等[29]将采用聚丙烯酰胺凝胶柱从黄精寡糖同系物中分离得到了具有抗病毒作用的聚合度单一的呋喃型直链黄精四糖，提示聚丙烯酰胺凝胶Bio Gel P2可以有效分离聚合度1～5的寡糖，并且添加碳酸氢铵可以减少填料的特异性吸附，改善分离性能。Wei等[30]依次采用大孔吸附树脂柱层析、活性炭柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析法从黄精低聚糖浸膏部位分离得到纯度92.6%，平均相对分子质量为1 471 Da的均一性寡糖。经鉴定该寡糖为单一葡萄糖组成的D-吡喃葡聚糖，分子中葡萄糖主要通过1→3和1→4苷键连接，构型多为β-糖苷键，也存在少量α-糖苷键。Jiang等[31]对猴头菌醇沉部位采用Sephadex G-25凝胶色谱纯化，得到了寡糖Hep-1-3，经检测其含量为91%，该方法分离效果显著，但分离时间长，洗脱剂消耗量大。Hao等[32]采用Sephadex G-50凝胶柱层析分离纯化，获得了水溶性的牛蒡寡糖BOS-2，该寡糖含量为98%，分子量为2 134 Da，是一种由葡萄糖和果糖1∶12组成，聚合度为13的菊糖构型的低聚果糖。凝胶色谱法是分离纯化寡糖最常用的方法，寡糖经过离子交换柱、大孔树脂或者活性炭层析柱进行粗分后，采用适宜的凝胶材料对其进行进一步纯化，均可得到纯度更高的均一性寡糖，而且凝胶柱色谱可根据分子量大小选择适宜的凝胶填料，洗脱液一般为水，操作简单。但该色谱材料容易被污染，而且随着分离时间增加，流速也会减慢。

2.2.2 亲水作用色谱法(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)

在组成糖链的单糖结构中有大量的羟基存在，这使得糖链具有较强的亲水性。由此研究者们发明了一种以材料表面官能团与糖链之间的亲水作用为基础的亲水作用色谱法(HILIC)。其中，分离糖类的固定相一般包括化学键合的二醇基、氨基、糖基、环糊精、聚乙二醇、嵌入酰胺或者氨基甲酸酯的烷基，以及聚合物键合相，如聚琥珀酰亚胺型PolyHydroxyethyl A、PolyCAT A 和PolySulfoethyl A，聚磷酸胆碱型KS-polyMPC等[33-35]。Zhai等[36]开发了一种新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相，该材料对极性化合物保留率高、选择性高且具有质谱相容性。同时，硼酸与顺式二羟基产生可逆性吸附和解析，因此可特异性分离含有顺式二羟基的糖类化合物。用于亲水作用液相色谱时，新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相在分离壳寡糖方面表现出很好的HILIC特性，其分配和吸附双模式组合机制，为糖类的分离分析提供了新的思路[37]。Yang[38]采用高效液相色谱法对比了巴戟天根头、根中、根尖这3个部位寡糖的分布规律，发现10株巴戟天相同部位中耐斯糖平均含量分别为45.76、59.31、65.04 mg/g。Liang[39]采用固相萃取(stationary phase extraction，SPE)下的HILIC模式对泽兰提取物进行分离，采用Click TE-Cys(100 mm×4.6 mm.id)色谱柱，分离出了蔗糖、棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖和筋骨草糖。该方法使得低丰度的寡糖得到了有效富集，大幅度降低了洗脱馏分的复杂程度，还可除去单糖、蔗糖及其他非寡糖类化合物，在上样后可直接采用70%乙腈洗脱以达到纯化寡糖的目的。

Yuan等[40]利用低共熔溶剂作为硅烷化和自由基链转移聚合反应介质，可控制备了一种葡萄糖量子点键合硅胶亲水色谱固定相，该固定相对糖基化合物等极性分析物具有较好的保留能力和分离选择性，并成功用于枸杞样品中果糖和葡萄糖含量测定，结果显示果糖浓度为3.4 mg/mL，葡萄糖浓度为2.2 mg/mL。碳量子点修饰的液相色谱固定相以其独特的优势为糖类的分离提供了一个更优选择。Yang等[41]制备了一种基于巯基-烯烃点击化学的聚丙烯酰胺型亲水作用色谱，成功将β-1,4-低聚半乳糖分离为DP 2～7的6个峰，分离度高，峰形良好。这一研究结构表明TE-UPAM固定相可以被很好地应用到极性化合物的分离当中。Fu等[42]发现中性糖类化合物在麦芽糖色谱柱上的具有典型的HILIC特点，同时采用顶替吸附-液相相互作用模型对糖类化合物的保留行为进行定量描述，并将保留公式，通过优化梯度的半制备HILIC进一步纯化了地黄洗脱液，得到了15个以上的峰，通过重复进样获得了毫克级化合物。Jiang等[43]考察了松三糖、棉子糖在两性离子亲水作用色谱柱Click TE-Cys上的色谱保留行为，在流动相为70%乙腈时，单糖、二糖、三糖按照极性由小到大依次被洗脱。这说明糖类化合物的极性越大，保留时间则越长。这可能是由于HILIC流动相中水相比例的降低，缓冲盐转移到了水相中，增加了其极性和厚度，使得溶质在水相中的分配系数增大，因此保留时间延长[44,45]。作者结合该数据建立了糖在Click TE-Cys色谱柱上的保留行为回归方程，该结果有助于亲水作用色谱材料的系统评价和评价方法的建立。Wang等[46]利用物理涂敷的方法将亲水聚合物以凝胶方式层层组装于硅胶表面，成功制备了一种亲水性色谱新材料。色谱性能评价表明:该材料表现出典型的亲水色谱分离机理，亲水分离范围很宽(乙腈体积75%～95%)，其最高柱效能达到168 133 塔板/米。考察了该固定相对10种糖标准品(D-核糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、肉苁蓉糖和果糖)的分离效果，发现10种糖按照极性在3层PAM-Sil固定相中完全分离。此外，对果糖和葡萄糖等异构体也可分离；由此说明PAM-Sil固定相对于大极性化合物具有更好的分离选择性。Fu等[47]采用二乙烯基砜活化化学方法制备了以谷胱甘肽为亲水性基团的硅基HILIC材料(命名为SiO2-DVS-GSH)。在HILIC模式下，用寡糖对新材料的分离性能进行了评价。以低聚果糖为研究对象，色谱分析结果表明低聚果糖的聚合度(DP)在2～26之间，分离良好，峰形良好。由于HILIC模式的主要保留机制是分析物在流动相和HILIC固定相上的“富水层”之间的分配相互作用[48]，随着DP的增加，分析物与SiO2-DVS-GSH表面“富水层”之间的相互作用增强；因此，可以对DP较高的低聚果糖进行洗脱。

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HILIC是以极性固定相和水溶性有机溶剂为流动相对极性化合物(如糖类)进行分离的一种方法，具有正相色谱和反相色谱完全不同的分离特性。HILIC的固定相上键合的基团不同，其保留机制也会有所不同。随着固定相种类的增多，HILIC也得到了快速发展，在极性化合物的分离中应用广泛并具有显著的优势，比如可以分离含有复杂糖链的糖类化合物，在分离聚合度较高的寡糖时也具有很高的分辨率。根据以上内容我们不难看出，亲水色谱材料种类丰富，在糖类化合物的分离分析中存在很大的潜力，可以为寡糖的分离提供更多、更优的选择。

2.2.3 离子交换色谱法(ion-exchange chromatography，IEC)

离子交换色谱法是以离子交换剂为固定相、利用被分离组分与固定相之间发生离子交换能力的差异而实现分离的一种液相色谱分离技术。离子交换色谱固定相上的离子基团可与待分离组分的某种基团结合，当用流动相洗脱时，寡糖按照结合能力从小到大的顺序依次被洗脱下来，而达到分离的目的。离子交换色谱法具有样品用量少、分离效率高、灵敏度高的优点，适用于在高pH的流动相下，分离酸性寡糖，但是其定性能力差，可与其他色谱法联用提高分离纯化效果。高效离子交换色谱-脉冲安培检测法(high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)，固定相一般为离子交换树脂，通常与脉冲安培检测器(pulsed amperometric detection，PAD)联用，待测组分生成的离子随着流动相通过离子交换树脂，与树脂中可交换的离子基团发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配来实现分离。

Qiu等[49]采用阳离子树脂-阴离子树脂-活性炭联用的方法，以10%乙醇溶液进行洗脱，分离得到水苏糖，该方法的研究有效地解决了从地黄中直接分离制备单体难度大、制备繁琐、单体纯度低等问题，得到了纯度较高的四糖(水苏糖)单体，该实验为制备地黄寡糖中各个单体提供了一定的研究基础。Ballance等[50]选用半制备离子型Pac-AS4A柱分离酸水解得到的褐藻胶寡糖，得到聚合度为5的寡糖，寡糖的纯度为96%。Li等[51]采用Pharmacia柱分离酶解法制备的褐藻胶寡糖，得到包括二糖和三糖的6种寡糖。Peng等[52]采用TSK-GEL-DEAE-2SW柱分离褐藻胶寡糖混合物，分离得到12个褐藻胶寡糖组分，各组分的纯度均高于97%。Hu等[53]采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析对木耳寡糖进行分离纯化，该色谱柱主要功能是脱蛋白作用，其脱蛋白率可以达到96%，是一种理想的分离纯化方法。

Ma等[54]采用HPAEC-PAD对巴戟天中的蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖进行了检测，这4种寡糖分离度良好。该实验中采用了Hamilton RCX-10色谱柱(4.1 mm×250 mm，7 μm)，填料为PS-DVB/三甲基铵交换树脂，交换容量可达到0.35 meq/mg，远远大于PRP-X100，可用于等度和梯度洗脱碳水化合物；对聚合度小于3的碳水化合物可以快速实现等度分离；基于碱性条件下不同糖类化合物会带不同的电荷，针对复杂样品进行梯度洗脱时，可通过调节流动相的浓度来分离各种糖类化合物。Alyassin等[55]使用CarboPac PA200色谱柱对16种浓度均为20 mg/mL糖的标准品混合物进行了分析，采用NaOH和CH3COONa水溶液梯度洗脱的HPAEC-PAD方法，可以在CarboPac PA200柱上同时分离16种标准的单糖、低聚木糖、阿拉伯低聚糖和糖醛酸，发现采用梯度洗脱可实现较高的分离度。CarboPac PA200为阴离子交换柱，无需衍生，可实现快速、重复分离；填充材料为疏水性聚合物薄壳型阴离子交换树脂，在pH 0～14范围内保持稳定，同时，碱性水溶液的线性梯度洗脱不仅提高了寡糖色谱柱的分离性，而且提高了分离度，且这种洗脱液有利于糖类在金电极上的阳极氧化，在较长时间下仍可有效分离低聚糖。Chen等[56]采用HPAEC-PAD对DP为2～6的5种壳寡糖标准样品进行分离和检测，建立壳寡糖的保留因子与聚合度的关系，根据建立的相关关系对未知的壳寡糖进行定性分析。结果表明，壳寡糖聚合度的对数值与其保留因子的对数值具有线性关系，利用线性回归方程对鉴定出样品中的4种未知壳寡糖分别为壳七糖、壳八糖、壳九糖和壳十糖,且测量误差≤5.66%。

2.2.4 石墨化碳色谱法(graphitized carbon chromatography，GCC)

石墨化碳液相色谱是一种常用于分离寡糖和糖结合物的分离方法，石墨化碳材料对寡糖具有良好的保留和分离选择性,尤其适用于寡糖异构体的分离，并且石墨化碳柱容量大，适合寡糖的制备性分离[57]。与糖类HPLC分析中常用的正相、反相和阴离子交换柱的分离原理不同，GCC的保留机制为填充剂和样品疏水相，电子供、受体之间的相互作用；分离机制与化合物分子空间结构和分子极性密切相关，化合物分子与石墨化碳结合越紧密，在色谱柱上的保留越强。Harrison等[58]通过联用GCC和线性离子阱质谱，将13C标记的蔗糖和蔗果三糖作为底物，通过2种酶催化合成果聚糖，结合其二级与三级质谱的碎裂模式，建立了分离和鉴定果聚糖异构体的液相色谱-质谱(LC-MSn)方法。Fu等[59]为了降低样品的复杂性，增加低聚糖含量，对地黄粗提物进行了石墨化碳固相萃取处理。先用5%、10%、15%的乙腈处理石墨化碳，再用50%的乙腈(含0.1%甲酸)洗脱，由于单糖不保留在石墨化碳柱上，因此用水即可去除粗提样品中的单糖和大部分非寡糖类化合物，使高纯度地黄寡糖得到有效富集。

2.2.5 反相液相色谱法(reversed-phase liquid chromatography，RPLC)

2.2.6 快速蛋白质液相色谱-示差折光检测法(fast protein liquid chromatography-refractive index detection，FPLC-RID)

FPLC-RID自动化程度高、分离效率高、无需化学试剂即可监测碳水化合物的分离，相比传统的FPLC，可用来检测没有紫外吸收的化合物，该方法扩大了糖类化合物的检测范围。Zong等[62]使用FPLC在0.2、0.3、0.4、0.5 mL这4个流速下对聚合度3～5的寡糖进行了纯化，在最佳分离条件下，DP 3～5的低聚糖得率分别为1.72、7.52、0.51%。该方法可快速、高效、自动地为地黄及其制品中寡糖RFOs的定性、定量分析提供依据。

2.3 毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

毛细管电泳法是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的分离技术，具备快速、高效、高灵敏度、分离效率高、样品与溶剂消耗量少等优势，在糖类分析中得到较好的应用。毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)是CE最简便，应用最广泛的分离模式，但是该模式只适合于分离硫酸化、乙酰化和磷酸化等点电荷的糖类。对于中性寡糖，由于其不带电荷，无荧光基团或发色基团，CE分离分析这些寡糖时常需衍生化或形成络合物使之带上荧光基团、发色基团或电荷。

Guo等[63]采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)对板蓝根多糖进行衍生化，通过HPCE分离分析，结果表明电泳作用可以使板蓝根寡糖组分按照分子量大小进行分离。该技术可以在短时间内很好地分离低聚糖，操作简单高效；样品制备采用荧光发色团标记低聚糖，以此来排除非还原糖[64]。对于不带电荷的糖类除了上述方法以外，也可以使用含硼酸根的化合物与糖络合带电或者使其在强碱条件下电离。糖的羟基具有酸性，可在强碱条件下解离，其中，还原糖半缩醛上的羟基酸性最强，相对其他位置的羟基更容易解离。Yang和Guo等[65,66]对比在酸性与碱性缓冲液条件下北沙参和南沙参水解的寡糖片段的分离效果，结果表明，在酸性条件下，结构相似的寡糖分离度较低，而碱性条件可促进糖与硼酸根络合，结构相似的寡糖能被更有效地分离，最终所得图谱更具特征性，且碱性环境下电渗流增加，缩短了分析检测时间。pH升高可增加电泳分离度，但强碱条件下糖会发生差向异构化和降解反应[67]，会导致基线漂移和峰形变差[68]，因此要控制pH在合理范围内。由于糖在碱性条件下带负电，采用CE进行阴离子分析时，也可以加入阳离子表面活性剂作为电渗流改性剂，用来改变电渗流的方向并提高样品的分离度。

3 中药寡糖结构分析方法研究进展

3.1 紫外光谱法(ultraviolet spectroscopy，UV)

UV主要用于判断寡糖中是否含有紫外吸收基团，但寡糖的紫外吸收通常较弱，因此，利用UV法进行寡糖含量测定时，需要将寡糖转变为糖醛酸衍生物。UV测定的是寡糖经过无机酸水解脱水产生的糠醛(戊糖)或糠醛衍生物(如羟甲基糠醛)与酚类化合物缩合生成的有色物质。Wu等[69]用3,5-二硝基水杨酸(DNS)作为显色剂，通过斑点显色情况判断寡糖的有无和种类，另外，展开剂的种类、配比、展开条件的不同都会对分析结果产生影响，该方法操作简便，结果直观，也较为常用，经常被用来做定性分析。

3.2 红外光谱法(infrared spectroscopy，IR)

红外光谱在寡糖的结构分析中主要用于官能团以及糖苷键构型的确定。寡糖的红外图谱主要特征峰有：3 300 cm-1处的一个强宽峰，对应-OH的伸缩振动，在2 936 cm-1附近有一个弱的伸缩带，对应-CH单键的伸缩振动；1 740 cm-1处的吸收峰代表糖醛酸的存在；1 640 cm-1和1 100 cm-1的吸收峰表示分别对应 C=O和C-O的伸缩振动；在1 400 cm-1左右的吸收表示-CH的弯曲振动；1 200～1 000 cm-1区域的强吸收代表C-O-C糖苷键的存在，C-C和C-OH键的伸缩振动，1 024 cm-1附近的吸收峰对应于寡糖的一个吡喃糖单元；930 cm-1和820 cm-1附近的典型吸收峰表明存在β型和α型糖苷键的呋喃糖环[70]。

3.3 气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)

气相色谱是鉴定寡糖糖苷链连接方式的主要手段之一。Bai等[71]采用气相色谱法对水提醇沉得到的党参寡糖进行了结构分析，将党参寡糖在120 ℃下用2 mol三氟乙酸(trifluoroacetic Acid，TFA)直接水解2 h，除去TFA之后，水解产物转化为糖醇乙酸酯后进行气相色谱分析。GC-MS分析结果表明，党参寡糖的主要单糖组成为果糖和葡萄糖(α-Glcp、β-Glcp、β-Fruf、β-Fru)，摩尔比为1.21∶1，对寡糖甲基化衍生后采用GC-MS进行分析，糖苷键连结方式为→1-α-D-Glcp,→2)-β-D-Fruf-1(→和β-D-Fruf-(2→。

3.4 高效薄层色谱法(high performance thin-layer chromatography，HPTLC)

Zhou等[72]采用HPTLC对巴戟天水提液中的成分进行定性分析，确定巴戟天药材及其产品中的3种寡糖分别为耐斯糖、1F-果呋喃基耐斯糖、蔗果三糖；通过对比显色剂苯胺-二苯胺-磷酸和苯胺-邻苯二甲酸的显色效果，发现只有在α-萘酚-硫酸做显色剂时，显色反应灵敏，斑点清晰，而且容易控制。因此，在该实验中将α-萘酚-硫酸作为显色剂。

3.5 质谱法(mass spectrometry，MS)

MS技术是寡糖结构分析最常用的方法，早期主要利用GC-MS来分析糖类的组成和连接方式，随着电离技术的发展，电子轰击质谱(EI-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、电喷雾-质谱(electron spray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)等软电离技术的发展，对于寡糖的分子量和糖残基的连接顺序的研究起到了很大的推动作用。一般用来测定大分子量寡糖的是MALDI-TOF MS和ESI-MS，其中MALDI-TOF MS测量的分子量能够达到100 000 Da。ESI-MS作为一种软电离技术，可获得多电荷的分子离子[M+nH]n+或[M-nH]n-，扩大可测定的分子量范围，对寡糖分子量和单糖组成种类进行分析可进一步推断寡糖的聚合度；在ESI-MSn中寡糖发生糖苷键断裂的机理为，未衍生的寡糖在断裂过程中发生质子转移，断裂后形成的不饱和六元环容易发生跨环裂解，产生具有表征其结构信息的特征碎片[73]。寡糖的连接键构型、连接顺序可通过ESI-MS的二级碎片结构得到，二者的联合应用也使得寡糖的定性定量分析更加快捷高效。因其所具有的高灵敏度、高精确度和快速定性等特点，ESI-MS已成为寡糖结构分析的重要技术之一。Luo等[74]对纯化的银耳寡糖TPH-1还原末端采用PMP进行衍生，ESI-MS分析结果显示，质荷比m/z687.1处为二糖连接两分子PMP的分子离子峰，应为[Glc A-Man-(PMP)2]的分子离子峰；m/z510.9处为甘露糖连接两分子PMP，应为[Man-(PMP)2]的分子离子峰。说明TPH-1为分子量356 Da的二糖，二糖的还原末端为Man，非还原末端为Glc A。Pu等[75]基于UPLC-QTOF MS(负离子模式)推断出了远志中的6个蔗糖酯类化合物和15个低聚糖酯类化合物，通过产生的分子离子峰、丢失基团以及碎片离子的质荷比，判断该化合物为阿魏酸与蔗糖成酯接连而成。Zhang等[76]以NaOH为填料制备固相甲基化柱，以CH3I为甲基化试剂，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用结合固相甲基化技术对不同生长环境人参中寡糖的甲基化产物进行了测定，通过对比与寡糖对照品相对保留时间和质谱碎片信息，证明人参中存在6种还原寡糖(麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖)和3种非还原寡糖(蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖)，而且该方法可以同时测定人参中9种寡糖的含量，为人参中寡糖的分布提供了测定方法。Luan等[77]采用FAB-MS对比了远志生品、蜜炙远志、甘草制远志、清水煮远志、远志木心中黄花远志素A、远志蔗糖酯A和远志蔗糖酯C的含量。实验结果表明远志寡糖酯类成分性质不稳定，在炮制过程中酯键发生了水解，与前期研究中远志甘草汁煮制后多种寡糖酯类成分和远志皂苷B含量降低，小分子有机酸含量增加的结论相吻合。Li等[78]对水提醇沉得到的人参低聚糖进行过甲基化处理，分离并鉴定出了12种低聚糖，采用UHPLC-Q-Orbitrap/MS对低聚糖进行了结构分析，其中Erlose为人参中首次报道的非还原性低聚糖，首次鉴定出了麦芽糖、蔗糖、麦芽糖三糖、丙酮和聂氏糖5种低聚糖。[M+NH4]+和[M+Na]+分别在m/z676.38和681.33有高强度的离子峰，[M+H]+在659.35处有低强度离子峰；低聚糖[M+Na]+的数据也为人参结构鉴定提供了更多的结构信息片段。

3.6 核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)

核磁共振(NMR)技术发展至今已经较为成熟，是糖类结构解析的重要方法之一，可判断糖类化合物的种类、糖与糖的连接位置、糖残基数目、糖苷键构型、糖与糖的连接顺序等[79]。NMR不需标准品即可进行定性分析，因此特别适用于分析结构未知的糖类，但待测组分必须是高纯度且重量在毫克级以上的化合物，且对化合物定性前，目标化合物需要进行分离纯化。糖类化合物的NMR图谱可选用四甲基硅烷或丙酮作为参比标准，测定溶剂多为重水(D2O)，在氘代吡啶、氘代二甲亚砜等非质子溶剂中，糖类化合物的谱图分辨率较好。NMR技术是糖类化合物结构研究的重要方法之一，该技术的应用可使糖类化学结构的研究更加准确高效，以便于更好地揭示糖类物质的作用机制以及生物活性。Xiao等[80]将从竹子中分离得到的木糖寡糖采用NMR进行结构表征，取15 mg木糖寡糖样品进行成分分析，结果表明竹粉中木糖含量为18.2%、阿拉伯糖、半乳糖含量分别为0.8%、0.2%，甘露糖、葡萄糖醛酸的含量均为0.1%。经过自动水解后，低聚糖含量为56.6%。Wang等[81]通过DEAE-Cellulose 52和Sephacryls-100过滤柱从牛膝提取液种连续分离得到一种新型寡糖ABW90-1，并通过单糖分析、甲基化分析、IR和NMR等手段对其进行了表征。该寡糖由(2→6)-β-D-呋喃果糖(Fruf)和2→1)-β-D-Fruf残基组成，末端为Glc和Fru残基。寡糖结构解析方法比较见表3。

表3 寡糖结构解析方法比较

4 总结展望

本文综述了中药寡糖的提取分离，纯化以及结构表征方面的研究进展。

寡糖在提取时，应该考虑溶剂对目标寡糖组分的溶解性，寡糖在提取溶剂中的稳定性，寡糖得率，寡糖纯度，提取时间，溶剂用量，溶剂环保性和安全性，所采用的设备是否方便操作等因素。目前，寡糖的提取溶剂较为常见的是水和乙醇-水溶液，采用水作为提取溶剂时，一部分多糖和蛋白质也会一起提取出来，给分离和纯化带来了一定难度，另外一些寡糖在水溶液也不稳定。因此，寡糖提取的另一种溶剂为乙醇-水溶液，但该方法的缺点是乙醇消耗量较大，而且对于药品的提取溶剂来说，并不是一种理想的溶剂。由此可见，目前对于寡糖来说，其提取溶剂的种类还是存在局限性，亟需发现新的溶剂系统，以适应不同种类寡糖的提取要求，在探索新的提取方法的同时，以高品质目标寡糖的得率为目标，将传统方法与新方法、新设备的优势进行结合，探索出一种绿色、经济、高效的提取方法。

寡糖的分离方法主要有膜分离法、液相色谱法和毛细管电泳法等。常规膜分离技术有微滤、超滤、纳滤、反渗析，以及结合电化学技术的电渗析、连续电除盐等。膜分离法分离效率高、能耗低、无污染，可实现分子级过滤过滤过程简单、易于控制，兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，在化合物分离纯化除杂方面具有自身独特的优势，缺点是该技术对设备要求和膜的要求较高，操作复杂，还受到压力、温度、时间等多种因素的影响。新型膜分离技术对膜的工作性能，膜通量、减轻膜污染、降低压力驱动消耗，甚至降低成本，简化膜的制造技术，延长单个膜的使用时间都提出了更高的要求。目前新型膜分离技术也已经产生，包括渗透汽化膜、液膜和动态膜等。柱色谱法在寡糖分离纯化方面应用极为广泛，根据分离材料、流动相、分离原理等不同，又分为凝胶排阻色谱法、亲水作用色谱法、阴离子交换色谱法、石墨化碳柱色谱法、反相高效液相色谱法等。该方法的重点是分离材料，可以根据寡糖的性质选择合适的分离材料，以达到最佳的分离纯化效果，而且目前糖类化合物的分离材料一直是研究的热点，在天然产物应用方面也已经较为成熟，因此寡糖的分离纯化会变得更加快捷高效，且具有更多的选择性。电泳法分离寡糖可采用柱前衍生，不经衍生的直接和间接紫外检测，激光诱导荧光检测，电极脉冲安培检测这四种方法，此外，间接紫外检测还可以对无法衍生化的非还原性寡糖及醛糖酸进行鉴定。目前CE在药物分析方面仍然具有特色和优势，并显示出较大的发展空间，但是仍旧存在多个重要瓶颈问题比如灵敏度、重复性、定性能力等等，这些问题也亟需改进和突破。

寡糖的结构鉴定一般采用紫外和薄层色谱可对具有荧光或可以显色的糖类进行简单定性，红外吸收光谱法主要鉴定寡糖中糖环骨架和官能团，一般用于寡糖结构的初步表征；质谱法一般用于测定寡糖糖链和分子量，是寡糖结构鉴定的重要方法之一；核磁共振波谱法是利用特定的原子核在给定的磁场中，只吸收特定射频辐射形成核磁共振信号，从而进行结构鉴定，通过糖残基中各位点元素的化学位移产生的信号可以获得寡糖的结构信息，通过信号峰面积的积分可得到残基的相对含量。寡糖的纯度、分子量及其连接位置、连结方式等特征可以通过GC、MS、NMR以及各种方法联用来进行测定。寡糖糖链具有复杂性和多样性，以上测定方法对多糖的性质、纯度、或用量等方面存在一定要求，也正是由于各种结构表征方法存在的种种限制，因此未来发展趋势一定是多种方法联合应用，寡糖的分离分析也是如此，因此寡糖的提取方法、分离技术和结构表征方法的不断发展，对其寡糖的开发及应用有着深远的意义。合理可行的方案一定可以实现寡糖高效制备、快速分离和精准表征，使得中药中的寡糖在食品、医药等领域发挥更加重要的作用。