马兜铃酸I致急性肾损伤的分子机制研究

王 帆，王 静，黄 恺，彭 渊，刘成海,，陶艳艳*

1上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所；2上海市中医临床重点实验室，上海 201203

马兜铃酸(aristolochic acid，AA)天然存在于马兜铃科植物中，具有抗肿瘤、抗感染、抗炎等功效，含AA的中药及成药制剂广泛应用于临床[1]，包括马兜铃属木香、防己、朱砂莲、细辛属的细辛、山慈菇等中药以及复方胃痛胶囊、喘息灵胶囊、十三味疏肝胶囊等中成药[2]。研究也表明，AA暴露与肾病和上尿路癌的发生存在高风险相关[3]；作为AA的主要成分之一，马兜铃酸I(aristolochic acid I，AAⅠ)同样具有肾毒性与致癌性[4]；长期服用含此类物质的中药可引起马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy，AAN)[5]。目前已有不少关于AAI肾毒性的研究，但全面表征其毒理机制的报道并不多[6]，大多为针对某一细胞或者信号通路的研究。因此仍需要进一步探索AAI毒性机制。转录组是细胞内所有基因转录产物的总和[7]，转录组学是对转录组的研究，涵盖了与RNA相关的内容，如转录、表达、功能等。为了更全面了解AAI肾毒性机制，本研究采用IIIumina高通量测序平台对肾组织进行转录组学测序，进行差异表达及GO、KEGG富集分析，以明确AAI致肾毒性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

AAI(纯度>98.5%，批号：3503)，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，4 ℃冰箱存放备用；羧甲基纤维素钠(批号：F20051103)，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 实验动物

雄性C57BL/6小鼠15只，体质量23～25 g，6～8周龄，SPF级，购于上海南方模式生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0010。于上海南方模式生物科技股份有限公司SPF级环境饲养，动物使用许可证号：SYXK(沪)2019-0003。所有操作均由上海南方模式生物科技股份有限公司实验动物管理和使用委员会(IACUC)审批通过(审批号：IACUC号2018-0026)。

1.1.3 试剂

血肌酐(serum creatinine，Scr)试剂盒(批号：20150526)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)试剂盒(批号：20150511)均购自南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent(批号：F919KB3054)、总RNA提取试剂盒(批号：B518811)均购自上海生工生物工程股份有限公司；反转录试剂盒(批号：AJ92014A，日本TAKARA公司)；扩增试剂盒(批号：AJF0343A，日本TAKARA公司)。

1.1.4 主要仪器

实时荧光定量PCR仪(美国Life Technonogy公司)；荧光倒置显微镜(Olympus IX70，日本)。

1.2 方法

1.2.1 AAI溶液配置

100 mg羧甲基纤维素钠溶解于20 mL双蒸水中配置成0.5%的混悬液。40 mg AAI加入20 mL 0.5%羧甲基纤维素钠混悬液中制备成2 mg/mL贮存液，超声震荡直至完全溶解，4 ℃保存备用。

1.2.2 动物分组及模型建立

小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(N，n=6)和模型组(M，n=9)。模型组小鼠以AAI 20 mg/kg剂量连续腹腔注射，每天1次，连续5天，正常组小鼠注射相同容积的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液。

1.2.3 样本采集

造模第6日，小鼠用3%戊巴比妥钠进行麻醉，打开腹腔取下腔静脉血，置于-80 ℃冰箱保存，用于测定Scr、BUN。摘除肾脏，一侧肾脏组织沿矢状面剖开，取二分之一用4%甲醛固定，用于HE染色；另取100 mg肾组织存于Trizol中用于提取RNA。

1.2.4 血清检测及HE染色

按试剂盒说明书进行Scr、BUN水平的检测。肾组织经4%中性甲醛缓冲液固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋，4 μm切片，苏木精-伊红染色(HE染色)，光学显微镜观察并拍照。肾组织病理改变参照文献[8]以评估肾小管和肾间质病变程度。

1.2.5 肾组织RNA提取及转录组测序

Trizol提取肾组织总RNA，Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)进行质量检测；使用Qubit 2.0 RNA检测试剂盒测定RNA浓度，包括mRNA分离/片段化、双链DNA合成、末端修复、末端dA-Tailing、桥头连接、连接产物纯化、片段大小分选以及文库扩增等；精确定量后回收的DNA，按1∶1比例定量混合，IIIumina HiSeq X Ten测序仪用于测序，产生150 bp的双端数据。建库测序及数据分析部分由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.2.6 质量控制及参考基因组比对

使用Trimmomatic(version 0.36)软件进行质控并去除接头，在此基础上过滤掉低质量碱基以及N碱基，最终得到高质量的Clean reads。hisat2(v2.2.1.0)软件用于将得到的Clean Reads与小鼠参考基因组(从NCBI中下载参考基因组，基因组版本为GRCm38.p6)进行序列比对，以获取在参考基因组或基因上的位置信息和测序样品特有的序列信息。各样本的有效数据量分布在5.99～6.83 G，Q30碱基分布在93.97%～95.01%，平均GC含量为47.90%。通过将reads比对到参考基因组上，得到各个样本的基因组比对情况，比对率为92.6%～98.23%。

1.2.7 差异表达基因筛选

导出各样本测序结果，并运用R语言中的“Affy”“limma”软件包分析差异表达基因。Affy包去除原始数据中系统误差，从而得到标准化的基因表达数据；Limma包用于对正常组织和肾损伤组织标准化之后的数据进行差异表达分析。筛选条件为P<0.01且差异倍数(fold change，FC)≥2.0，获取上调和下调的差异基因。使用Pheatmap包绘制热图和火山图。

1.2.8 差异表达基因的GO和KEGG富集分析

得到差异表达基因后，采用“clusterProfiler”“colorspace”“enrichplot”“ggplot2”“org.Mm.eg.db”“stringi”R语言包对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，筛选条件为P.value cutoff<0.05和Q.value cutoff<0.05。计算生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)的基因富集数，最后将排名前20的GO生物过程和KEGG通路绘制为气泡图。

1.2.9 差异表达基因的qRT-PCR验证

基于转录组结果，选择两组间FC最为明显的前5个基因(见图3)进行qRT-PCR验证。使用NCBI在线引物设计软件Primer-Blast设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成(基因名称、引物序列见表1)。Trizol提取肾组织总RNA，采用试剂盒进行逆转录，按照SYBR Premix Ex Taq II荧光染料法实时定量试剂盒说明进行cDNA扩增，每个样品重复3次。以β-actin为内参，采用2-△△CT法进行分析定量。

表1 荧光定量PCR各基因引物序列

1.2.10 统计学方法

2 结果

2.1 AAI处理小鼠肾损伤的血清生化和肾组织病理变化

分别对正常组、模型组小鼠进行血清生化检测与肾组织HE染色。结果发现，与正常组相比，模型组小鼠Scr增高约12倍、BUN增高约3倍(见图1A、图1B)。HE染色显示，正常肾组织结构正常，肾小球、肾小管、肾间质均未见到明显改变；模型组肾小球水肿、肾小球固缩，近曲小管上皮细胞脱落(见图2)。

图1 正常组与模型组小鼠血清生化变化

图2 正常组与模型组小鼠肾组织病理变化(×100，标尺=100 μm)

2.2 AAI处理小鼠肾损伤差异表达基因筛选及GO富集分析

对AAI处理小鼠表达差异基因进行筛选与GO富集分析(见图3)。发现达到筛选标准的基因(FC≥2.0且P值<0.01)共有4 975个，其中上调基因有2 511个，下调基因有2 464个。热图(见图3A)显示出多个基因在两个组别中的表达水平。与正常组相比，模型组主要有以下基因发生差异性表达：Kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc等。火山图(见图3B)用于展示基因表达差异的分布，其中横轴为差异倍数的对数，越偏离中心差异倍数越大；纵轴为多差异显著性P值的负对数，值越大表明差异越显著，红点代表显著上调的基因，绿点代表显著下调的基因。

图3 AAI作用下正常组与模型组小鼠差异表达基因

2.3 AAI处理小鼠肾损伤差异表达基因的生物功能分析

为进一步了解差异表达基因的功能及其在分子水平上的作用，并针对差异表达基因进行GO注释(见图4)。Gene Ratio表明差异基因中与该Term相关的基因数与差异基因总数的比值，圆圈大小代表基因的多少，Qvalue为对P值进行统计学检验的Q值，Qvalue值越小说明富集程度越明显。

图4 AAI作用下差异表达基因的GO注释

GO-BP分析显示涉及的生物学过程主要有：小分子分解代谢过程；中性粒细胞参与的免疫应答；胞外间质组织；脂肪酸代谢过程；有机酸分解代谢过程；羧酸分解代谢过程；对有毒物质的反应；免疫应答；对金属离子的反应；血小板脱粒等。

GO-CC分析结果提示涉及的细胞组分主要有：颗粒腔；细胞质囊泡腔；质膜的外侧；含胶原的细胞外基质；血液微粒；血小板α颗粒；过氧化物酶基质；微体腔等。

GO-MF分析结果提示涉及的分子功能主要有：硫化合物的结合；酰胺结合；氧化还原酶活性；抗氧化活性；氨肽酶活性；过氧化物酶活性；胱甘肽过氧化物酶活性等。

2.4 马兜铃酸I处理小鼠肾损伤差异表达基因的KEGG分析

对AAI作用下表达的差异基因进行KEGG富集分析(见图5)，其中富集因子(enrichment score，ES)代表基因的富集程度，P-value值越接近0表示富集程度越显著。结果发现与AAI处理后肾损伤相关的通路包括JAK-STAT、NF-κB、PPAR信号通路；补体系统激活和凝血级联反应；过氧化反应；糖酵解/糖异生、胰岛素抵抗；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解；类固醇激素合成等途径。

图5 AAI作用下差异表达基因KEGG富集分析

2.5 差异表达基因的qRT-PCR验证

在表达的差异基因中挑选5个差异基因，以β-actin为内参，运用qRT-PCR以验证RNA-seq的可靠性(见图6)。结果发现，与正常组相比，模型组Kap基因表达量明显减少；Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc基因表达量显著增加，与转录组结果一致，验证了转录组结果的可靠性。

3 讨论与结论

AA的毒性作用早在20世纪90年代已被报道，随后被世界卫生组织国际癌症研究机构列为一级致癌物[9]。目前我国已禁止诸如广防己、关木通等AA含量较高药材的使用，而相对含量较低的马兜铃科植物及其制剂仍应用于临床治疗[10]。AAI是AA的主要成分，不同中药材中AAI含量亦不同，如细辛类药材中AAI含量在10 μg/g左右[11]，朱砂莲中AAI的含量介于0.938 6～3.567 5 mg/g之间[12]。朱砂莲临床给药5～10 g时AAI量达到9.386～35.675 mg之间。本文参考他人研究[13,14]，小鼠以AAI 20mg/kg剂量给药5天，即出现明显肾损伤：血肌酐、尿素氮均明显升高；肾小球水肿、肾小球固缩，近曲小管上皮细胞脱落。

RNA-seq是以高通量测序技术为基础，对组织细胞中的所有mRNA进行高通量测序分析的技术。本研究利用转录组学对AAI处理的小鼠肾组织RNA进行转录组学分析，发现与正常组差异表达基因共4 975个，其中上调的基因有2 511个，下调的基因有2 464个，其中差异表达基因中前5位为kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc。

Kap为肾脏雄激素调节蛋白，是肾脏近端肾小管细胞中一种具有高度特异性，并且受到严格调节的蛋白，研究表明Kap与亲环蛋白B相互作用可以保护近端小管细胞免受环孢霉素A毒性的影响[15]。Spp1也被称为骨桥蛋白，是一种细胞外基质趋化因子样磷酸糖蛋白，与免疫调节，肿瘤发生和细胞信号传导相关[16]，有研究发现Spp1的上调可激活NF-κB信号通路促进癌症进展[17]。Aldh1a2属于醛脱氢酶1家族，参与肾脏发育过程中内源性全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)的合成[18]。作为一种维生素A的活性代谢产物，ATRA在细胞增殖，分化以及凋亡中均起着重要作用[19]。Serpine1为1型纤溶酶原激活物抑制剂，许多研究指出其在癌症中存在异常表达，如口腔鳞状细胞癌，食道癌，膀胱癌等[20]。Tnc是一种大分子细胞外基质(ECM)糖蛋白，在胚胎发育过程中高度表达[21]。它能够与ECM结构蛋白和细胞表面受体(如EGFR、整联蛋白)结合，激活下游途径，从而调节细胞的粘附，扩散，迁移和增殖，研究显示Tnc是促进成纤维细胞增殖的主要成分，在肾纤维化中起着关键作用[22]。但在急性肾损伤期，Tnc亦可被诱导，进而增强Wnt/β-catenin信号传导，以起到保护肾脏的作用[23]。上述基因与AAI肾毒性相关报道不多。

AAI肾毒性差异表达的基因主要在小分子代谢过程、胞外间质组织以及中性粒细胞参与的免疫应答等GO分类中显著富集。KEGG分析表明差异表达基因在JAK-STAT、NF-κB信号通路；过氧化反应；糖酵解/糖异生；胰岛素抵抗；缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解等途径中富集明显。由此提示AAI导致的肾毒性可能与炎症反应、氧化应激、糖代谢等途径相关。

鉴于AAI对肾脏具有明显的毒副作用，临床上在使用青木香、朱砂莲、寻骨风[24]等含马兜铃酸中药的过程中应注意监测肾功能；同时，转录组学揭示的AAI肾毒性的基因及相关信号通路，可能为AAI肾毒性提供一定的治疗思路。