基于网络药理学和指纹图谱的一枝蒿抗乙肝病毒质量标志物预测分析

毛 艳，刘荣昌，丁 曼，贺金华*

1新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004；2新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011

一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)为菊科蒿属植物，是新疆维吾尔族和哈萨克族民间传统常用药材，主要分布于新疆天山山脉、阿勒泰山脉等地草原、山坡或林下。现收载于卫生部《药品标准》维吾尔药分册、《维吾尔药志》(上册)和《中华本草》(维吾尔药卷)。一枝蒿具有清热解毒、祛风凉血、抗HBV、抗病毒、保肝降酶、调节免疫及健胃促消化等作用，临床主要用于病毒性感冒和肝炎等疗效显著，在民间特别是维吾尔医院中广为应用[1]，据新疆维吾尔医院处方调查显示，一枝蒿用量之大堪称维药成方制剂之最，且药物制剂品种多样。新冠肺炎疫情期间，新疆卫生健康委组织专家结合新疆地域特色，制定并印发了“新疆版”中医药防治方案，复方一枝蒿颗粒以首选药入选其中，用于抑制呼吸系统炎症和抗病毒。

本文建立了一枝蒿药材的指纹图谱，并对色谱峰进行对照品指认，同时运用网络药理学对一枝蒿中多种成分与乙型病毒肝炎(HBV)的相互作用关系进行研究，旨在为全面控制疆一枝蒿的质量提供依据，并从整体的角度探讨一枝蒿治疗HBV可能的药效物质基础及作用机制，为新疆一枝蒿的质量标志物的研究奠定基础，并为后期进一步开展细胞生物学实验和动物模型实验提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1260 series快速高效液相色谱仪(美国Waldbronn Agilent Technologies公司)；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；ASBDT型超声波清洗器(频率40 kHz，功率240W，上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 材料

对照品一枝蒿酮酸(批号20170710，含量测定按99.9%计)，购自中国科学院新疆理化技术研究所；绿原酸(批号：110753-201415，含量：96.6%)、芦丁(批号：100080-201409，含量：92.6%)、芹菜素(批号：111901-201102，含量：99.6%)、蒙花苷(批号：1115283-201911，含量：98.5%)、洋艾素(批号：111879-2010011，含量：99.4%)均购自中国食品药品检定研究院；蔓荆子黄素(批号：Must-15092905，含量：99.09%)、木犀草素(批号：Must-16011015，含量：98.8%)购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯(Fisher公司)；水为纯化水。

18批一枝蒿药材由新疆维吾尔自治区药物研究所何江研究员鉴定为菊科植物新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.，简称AR)的地上部分或全草。18批一枝蒿药材具体产地信息见表1。

表1 一枝蒿药材信息

1.3 基于网络药理学预测一枝蒿Q-Marker

1.3.1 一枝蒿“活性成分-HBV靶点”的构建与分析

以“新疆一枝蒿”、“ArtemisiarupestrisL.”为关键词在中国知网(https://www.cnki.net/)、万方(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html)、维普(http://www.cqvip.com/)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行检索，根据文献收集药效化合物，建立成分数据库，并将化合物在TCMSP数据库进行口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug likeness，DL)筛选，筛选条件设置为OB≥30%，DL≥0.18。在Disgenet、GeneCards、HERB数据库以“乙型肝炎病毒”或“Hepatitis B Virus(HBV)”进行搜索，收集疾病靶点。

1.3.2 “一枝蒿-潜在靶标-乙肝病毒”蛋白相互作用网络(PPI)的构建

在GeneCards、HERB、DisGenet数据库以“乙型肝炎病毒”“Hepatitis B”进行靶点搜索，获得化合物和疾病的交集靶点，上传交集靶点至STRING数据库，生物属性设置为“Homo sapiens”置信度设置为High confidence(0.700)并删除游离的靶点，其余设置保持系统默认，并将得到的结果以TSV格式保存。最后用安装CytoNCA插件的Cytoscape 3.8.0软件进行拓扑网络可视化分析，其中核心靶点筛选根据度中心性(degree centrality)和介数中心性(betweenness centrality)分别大于两倍中位数、接近中心性(closeness centrality)大于中位数确定。

1.3.3 GO功能富集分析与通路分析

基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析主要用于描述基因靶点的功能，包括分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)、和细胞组分(cellular component，CC)三个部分。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析可以得到潜在靶点所富集的信号通路。通过安装有org.Hs.eg.db、ggplot2、enrichplot数据包的Rstudio软件进行GO功能富集分析、clusterProfiler数据包进行KEGG通路富集分析，以P≤0.05的条件收集结果，并利用Cytoscape进行可视化分析。

1.4 一枝蒿指纹图谱研究

1.4.1 供试品溶液的制备

取本品粉末(过3号筛)约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入50%甲醇水25 mL，超声处理45 min(功率250 W，频率40 kHz)，摇匀，滤过(0.45 μm)，取续滤液，即得。

1.4.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、芦丁、蒙花苷、木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素、蔓荆子黄素和洋艾素对照品适量，分别加甲醇溶解，制成每1 mL溶液含39.9、70.2、49.2、27.8、70.0、47.1、49.3、53.5 μg的混合对照品溶液。

1.4.3 指纹图谱色谱条件

色谱柱：Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为甲醇、B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～10 min，5% A→25% A；10～25min，25% A→38% A；25～40 min，38% A；40～100 min，38% A→85% A；100～105 min，85% A→95% A；105～110 min，95% A→5% A；110～120 min，5% A)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm；进样量：10 μL。

2 结果

2.1 基于网络药理学预测一枝蒿Q-Marker

2.1.1 一枝蒿“活性成分-HBV靶点”的构建与分析

去除缺少靶点信息的化合物并结合文献挖掘后，共筛选出15个具有生物活性的化合物，结果见表2，“活性成分-HBV靶点”网络图见图1，共407个节点，745条边，体现了新疆一枝蒿治疗乙肝的多成分、多靶点协同作用的特点。

表2 具有活性化合物相关信息

图1 活性成分-靶点网络关系

2.1.2 PPI网络分析

PPI可视化网络图和核心靶点分析结果分别如图2、表3所示，其中节点的形状越大、颜色越深，表明该节点可能和HBV的关系越紧密。

表3 PPI拓扑分析靶点信息

图2 新疆一枝蒿和乙肝蛋白相互作用网络

2.1.3 GO功能富集分析与通路分析

经过GO富集分析(见图3)共得到1 725条富集结果，其中生物过程1 592个，主要涉及对细胞对氧化应激的作用、细胞对化学应激的反应、对药物的反应；细胞组分25个，主要涉及膜筏、蛋白激酶复合物、转移酶复合物，转移含磷基团等过程；分子功能108个，主要涉及类固醇结合、核受体活性、配体激活转录因子活性等。

图3 GO生物富集分析柱状图

KEGG富集TOP 20作用通路(P<0.05)如图4所示，结果显示：关键通路7条，其中前20条主要信号通路包含PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路等。

图4 KEGG富集分析气泡图

2.1.4 活性成分-靶点-通路分析

经过KEGG通路分析结果，将通路中的靶点映射到化合物中，并利用Cytoscape构建“活性成分-靶点-通路”网络图(见图5)。结果显示：该网络由76节点和260个边组成，包括11个活性化合物、44个靶点和20个信号通路。其中表明，一枝蒿可以通过多种化合物、多个靶点作用于多种途径，从而达到治疗乙型肝炎病毒的效果。

图5 成分-靶点-通路网络图

2.2 一枝蒿指纹图谱研究

2.2.1 精密度

取同一供试品溶液(S3)，按“1.4.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果，各共有峰相对保留时间的RSD <0.10%(n=6)，相对峰面积的RSD <3.44%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性

取同一供试品(S3)6份，按“1.4.1”项下方法平行制备供试品溶液，再按“1.4.3”项下色谱条件下进行测定，记录色谱图。结果，各共有峰相对保留时间的RSD<0.10%(n=6)，相对峰面积的RSD<4.93%(n=6)。表明重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求(RSD≤5%)。

2.2.3 稳定性考察

取同一供试品溶液(S3)，按“1.4.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、24、48 h进样测定，记录色谱图。结果，在48 h内各共有峰相对保留时间RSD<0.47%(n=6)，相对峰面积的RSD<4.58%(n=6)。表明供试品溶液室温放置在48 h内稳定。

2.2.4 指纹图谱的建立

按“1.4.1”项下方法制成18批一枝蒿药材供试品溶液，按“1.4.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，确定共有峰18个，将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A版中，以S3为参照图谱，采用中位数法，设定时间窗宽度为0.2，生成对照图谱(R)，多点校正法建立指纹图谱[10](见图6)。

图6 一枝蒿药材的指纹图谱

2.2.5 指纹图谱共有峰的标定及相似度评价

采用对照品比对，指认其中8个共有峰，分别为绿原酸(1号峰)、芦丁(5号峰)、蒙花苷(11号峰)、木犀草素(12号峰)、一枝蒿酮酸(14号峰)、芹菜素(15号峰)、蔓荆子黄素(16号峰)、洋艾素(18号峰)。一枝蒿药材及混合对照品溶液的HPLC图见图7，以对照指纹图谱为参照，进行共有峰相似度分析，结果见表4，S2、S4、S14三批药材相似度在0.868～0.883，相似度较低。

图7 混合对照色谱图(A)及样品色谱图(B)

表4 18批一枝蒿的相似度评价结果

2.2.6 聚类分析(HCA)

以18批一枝蒿药材的18个共有峰面积导入SPSS 23.0软件对样品进行聚类分析，聚类方式选择离差平方和、样品的测量区间选择欧式距离的平方[11]，结果见图8。由图可知，当欧式距离的平方大于10时，一枝蒿药材S1～S3、S8、S10～S12、S14、S17、S18聚为1类，S4～S7、S9、S13、S15、S16聚为2类。系统聚类分析大致可将不同产地区分开，产地为新疆伊犁的一枝蒿药材聚类趋势较一致，但产地为新疆富蕴和新疆阜康的样品未按产地归类，说明产地只是一枝蒿药材质量的影响因素之一，不能完全用产地来评价药材质量。

图8 一枝蒿药材聚类分析

2.2.7 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

为更好地观察组间差异，本实验将18批一枝蒿药材共有峰面积作为变量，导入SIMCA-P 14.1软件，采用有监督模式的OPLS-DA进一步分析不同产地一枝蒿的差异性。模型拟合参数结果为R2X=0.678，R2Y=0.714，模型预测参数Q2=0.599，均大于0.5，表明建立模型的预测能力和解释能力均较好。OPLS-DA得分图见图9，可看出18批样品可以按照产地聚为3类，即3个产地的一枝蒿明显归为3类，进一步说明不同产地的一枝蒿在成分上存在着差异。为明确一枝蒿组间差异性成分，结合变量重要性投影(VIP)正态分布图(见图10)，筛选出贡献较大的10个变量(VIP>1)，VIP由大到小依次为：峰3>峰16(蔓荆子黄素)>峰13>峰14(一枝蒿酮酸)>峰8>峰9>峰5(芦丁)>峰18(洋艾素)>峰4>峰15(芹菜素)。结果表明这10个成分在区分不同产地、批次的一枝蒿药材时可以起到重要作用，是引起3个产地差异的主要标志性成分。

图9 OPLS-DA得分图

图10 差异性标志物VIP图

3 讨论与结论

本研究以刘昌孝院士提出的质量标志物(Q-Marker)为基础，通过网络药理学和指纹图谱对一枝蒿的质量标志物进行预测分析。采用网络药理学与指纹图谱技术相结合评价中药的质量优劣，有效避免以某单一成分含量来评价中药优劣的弊端。研究中对18批不同产地、批次的一枝蒿样品构建了指纹图谱，然后运用相似度评价、HCA与OPLS-DA分析对其进行综合评价，得分情况说明不同产地一枝蒿药材的综合质量存在差异，有明显的地域性区分，这进一步说明该方法可以简便快捷较可靠地应用于一枝蒿的质量控制。

通过对网络药理学构建的“活性成分-靶点”“成分-靶点-通路”网络图分析，可以得出一枝蒿治疗乙肝病毒可以通过多成分调控PPI网络中的AKT1、EGFR、SRC和ESR1等关键靶点，作用于PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路和Ras信号通路等关键信号通路发挥药效作用。EGFR是一种受体酪氨酸激酶，可触发对细胞过程至关重要的信号事件，包括Ras-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K-Akt和JAK-STAT通路。在用其配体表皮生长因子(EGF)刺激后，EGFR会自动磷酸化以激活这些信号通路[12]。迄今为止，据报道EGFR在不同类型病毒的进入机制中发挥关键作用，例如人类巨细胞病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和呼吸道合胞病毒。Chen等[13]研究表明IFN-α可能通过调控PI3K/AKT通路抑制mTOR、p70S6K的磷酸化水平，从而缓解HBV引起的纤维化和肝功能损伤。Liu等[14]报道乙肝病毒X蛋白结合蛋白在肝癌细胞中高表达，可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞增殖和迁移。

在筛选活性成分的过程中，degree值排名靠前有槲皮素(degree=187)、β-谷甾醇(degree=109)、木犀草素(degree=100)、豆甾醇(degree=86)、陆地棉苷(degree=53)、一枝蒿酮酸(degree=51)、金圣草黄素(degree=49)、金合欢素(degree=37)、山柰素(degree=28)、艾黄素(degree=20)连接度均大于10倍中位数，由于槲皮素、β-谷甾醇、胡萝卜苷和豆甾醇这些成分广泛存在于多种中药材中，具有多种生物活性，因此不能作为辨别药材质量的质量标志性成分。

本文根据刘昌孝院士提出的质量标志物五大原则：可测性、特有性、有效性、中医药理论的关联性、溯源性来筛选作为中药安全性和有效性的标志性物质，而化学成分可测性是中药Q-Marker确定要素之一。新疆一枝蒿中黄酮及倍半萜类化学成分含量较为丰富，本课题组前期开展大量的一枝蒿成分含量测定研究，包括针对不同产地、不同的采收期一枝蒿药材及其复方一枝蒿胶囊、芩蒿滴鼻剂中共有成分的定量检测[15-17]，其中可测成分为一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素、蔓荆子黄素、芹菜素、6-去甲氧基-4′-O-甲基茵陈色原酮和洋艾素。基于此，一枝蒿中的黄酮类及倍半萜类成分符合Q-Marker“可测性”的内涵，可作为候选Q-Marker。而网络药理学筛选得到的艾黄素、金圣草黄素、陆地棉苷、金合欢素在一枝蒿药材中含量较低，基于成分可测性角度，不适合作为评价一枝蒿药材质量的标志性成分。

为进一步明确一枝蒿的质量标志物，本研究采用HPLC对18批不同产地、批次的一枝蒿进行研究，确定18个共有峰，通过对照品比对指认了8个共有峰，分别为绿原酸、芦丁、蒙花苷、木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素、蔓荆子黄素和洋艾素；相似度在0.868～0.984，表明不同产地、批次一枝蒿化学成分相似度较高，但存在一定差异；通过OPLS-DA分析发现共有峰芦丁、蔓荆子黄素、一枝蒿酮酸、洋艾素和芹菜素是不同批次一枝蒿药材的重要差异性成分。

综上所述，根据网络药理学结果，木犀草素和一枝蒿酮酸度值排名靠前，可将这2种成分作为一枝蒿的Q-Marker；根据指纹图谱共有峰及含量结果分析，绿原酸、一枝蒿酮酸、芹菜素、蒙花苷、芦丁含量较高，但绿原酸和芦丁在多数中药材中广泛存在，不可作为质量标志性成分。一枝蒿酮酸在一枝蒿药材中含量较高，且有研究报道一枝蒿酮酸具有保肝[18]，抗病毒[19]，抗乙肝病毒等作用，可作为一枝蒿的Q-Marker。Chiang等[20]研究表明芹菜素对单纯疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒等具有良好的抗病毒活性，可以考虑作为一枝蒿潜在的Q-Marker。Li等[21]发现木犀草素对粪肠球菌有抑制作用，且其能干扰病毒的复制、抑制病毒引起的细胞凋亡，适合作为一枝蒿潜在的Q-Marker。基于化学成分有效性及指纹图谱及化学计量结果分析，初步预测一枝蒿酮酸、芹菜素、木犀草素和蒙花苷为一枝蒿中潜在的Q-Marker，其质量标志物的确定，为全面控制和评价新疆一枝蒿质量提供了科学依据，为新疆一枝蒿药材的进一步开发应用提供理论参考。但考虑到本研究使用的五个数据库更新情况和预测靶点的机制的差异，仍然具有一定的局限性，后续仍需通过药效实验对通路和靶点进行验证，以进一步确定本研究预测结果的准确性。