基于数据挖掘与网络药理学分析陈可冀主编之清宫系列书籍治疗骨关节炎外用方的用药规律*

张婷 曾建伟 戴雨婷 吴广文 陈俊

（1 福建中医药大学中西医结合研究院 福州 350122；2 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室福州 350122；3 福建中医药大学中西医结合学院 福州 350122）

骨关节炎（OA）是关节炎最常见的形式，也是全球慢性疼痛和残疾的主要来源，特别是膝骨关节炎，且其为退行性病变，患病率随着年龄的增长而增加。OA 系由创伤、肥胖等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生[1]。按照国家中医药管理局制定的中华人民共和国中医药行业标准[2]，OA 属于骨痹范畴。临床上以患病关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限为最常见症状[3]。中医药在OA的防治方面具有一定优势[4]。结合现代研究[5～7]OA 证候分类可分为肾虚髓亏、风寒湿阻、瘀血阻滞、痰瘀互结等证型。由于所处朝代靠后及诊疗对象地位特殊，一些学者认为清代御医博通经籍，其在辨证论治、选方用药方面经验丰富且严谨慎重、竭心尽力，疗效往往较为显著[8～10]。清宫系列书籍由国医大师陈可冀院士主编。笔者以该书为基础，收集其治疗OA的方剂，利用数据挖掘技术，整理、分析清宫治疗OA 的用药规律及组方规律，以期为清宫系列书籍治疗OA 外用方剂的挖掘和传承工作提供参考。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 原始资料采集 研究方剂来源于陈可冀主编之清宫系列书籍：《清宫医案集成》《清宫配方集成》《慈禧光绪医方选议》《清宫膏方精华》《清宫医案精选》《清宫医案研究》《清代宫廷医学精华》《清宫外治医方精华》。根据国家中医药管理局制定的骨关节炎诊疗标准[2]，采集其主治涉及“腰膝等关节隐隐疼痛、屈伸、转侧不利、筋骨疼痛、脚膝拘挛、骨节僵硬、筋骨不舒”等病症的方剂。

1.2 资料数据预处理 根据本研究挖掘目标，采用的预处理方法包括数据整理、变换，即统一规范中药名称、简约分割冗杂方剂[11]。对一些名称不完整的中药予以剔除，名称完整中药参照《中药学》[12]教材将中药名进行统一规范，形成标准名称，如怀牛膝、怀膝、牛膝统一规范为牛膝，川独活、独活统一规范为独活等。

1.3 数据挖掘方法 采用Excel 建立数据库，内容包括具体方剂名、中药名称。运用中医传承辅助系统（V3.0）软件（中国中医科学院中药研究所提供）统计每味药物的使用频数，并进一步分析其功效、性味、归经。基于此进行用药关联分析和聚类分析，研究其用药规律。

2 结果

2.1 药物频次、性味、归经及功效统计结果 共收录方剂103 首，涉及中药439 味。439 味中药共出现1 232 次，其中出现频次≥10 次的中药共21 味，占总药味数的4.78%。从统计数据来看，中药使用频次在前10 位的是：乳香、当归、没药、防风、木瓜、红花、羌活、独活、白芷、川芎。见表1。对中药进行功效、性味、归经分析，功效频次在前4 位的是活血化瘀类、祛风湿类、解表类、补虚类；使用性温、平，味辛、苦药物的频次较多，药物归经以肝、脾经为主。见表2～表3。

表1 医案处方中频次较高的药物

续表

表3 频次≥10 的中药性味情况（次）

2.1.1 医案处方中药物的四气分布 参照《中药学》[12]教材对高频中药药性进行归纳、统计和分析。高频中药以性温为主，占比50%，其次为性平，占比23%。见图1。

图1 药性图

2.1.2 医案处方中药物的五味分布 参照《中药学》[12]教材对高频中药药味进行归纳、统计和分析。结果显示高频中药以味苦、辛为主，分别占比37%和37%，其次为味甘，占比18%。见图2。

图2 药味图

2.1.3 医案处方中药物的归经分布 参照《中药学》[12]教材对高频中药归经进行归纳、统计和分析。若一味中药有多个归经，则全部统计在内，结果显示，药物归经以肝经（24%）、脾经（18%）、心经（14%）、肺经（10%）和肾经（10%）为主。见图3。

图3 归经图

2.1.4 医案处方中药物功效频数统计 参照《中药学》[12]教材对药物功效进行归纳、统计和分析。结果显示，功效频次在前4 位的是活血化瘀类（22%）、祛风湿类（16%）、解表类（15%）、补虚类（12%）。见图4。

图4 功效图

2.2 医案处方的关联规则分析 将支持度分别设为10%、15%、20%，药物关联图用“网络展示”。见图5。设置支持度为10，置信度为0.7，得到常用药对及组合。见表4。对所得药对进行关联规则分析。结果见表5。

图5 中药关联网络展示图

表4 支持度≥10 的中药组合频次情况

表5 支持度≥10 的药物关联规则

2.3 方剂的聚类分析 依据关联规则分析的结果得到的方剂聚类分析图。见图6。聚类得到的核心组方见表6。统计出现的18个组合中含有12 味药，总出现的频次为219，分析结果发现：其中含有当归或乳香的组合出现频次较高。且这12 味药中的当归、没药、乳香、红花、独活、白芷、川乌、川芎、防风9 味药在频次统计中频率都排在前11，故将其视为高频药物。此9 味药合用有祛风除湿、活血通经、祛瘀止痛的功效。用kmeans 算法基于其药物种类及出现频次将其分为五类。Ⅰ类，当归-乳香-防风-羌活-大青盐-醋；Ⅱ类，防风-当归-乳香-天麻-细辛-白芷；Ⅲ类，牛膝-独活-羌活-木瓜-甘草-防风；Ⅳ类，羌活-川乌-草乌-白鲜皮-红花-木瓜；Ⅴ类，没药-乳香-当归-木瓜-红花-防风。见图6A。再用kmeans 算法做出回归模拟方程验证其分类的合理性。见图6B。可以作出回归方程证明了其分类合理性，五类药物都在回归线附近，进一步证明了其分类的科学性。

图6 聚类分析结果

表6 基于关联规则分析聚类得到的核心组方

2.4 新方剂组合 基于关联规则与聚类分析的结果，再综合药物的性味归经结果，将关联分析出的高频药物，加上羌活可祛一身上下之风湿，再加上细辛更可使药力直达病所，促进药物吸收，因而将羌活、独活、白芷、防风、川乌、川芎、当归、乳香、没药、红花、细辛这11 味药组合为一个新的治疗骨关节炎的外用方，命名为荣筋祛痹方。其药物占比分析见图7。再进一步用网络药理学来验证荣筋祛痹方治疗骨关节炎的理论依据。

图7 荣筋祛痹方药物频率统计图

2.4.1 荣筋祛痹方药物活性成分筛选及靶点预测将上述综合药物性味、归经、功效及高频药物的分析结果，基于关联分析与聚类结果组出的新方荣筋祛痹方（羌活、独活、白芷、防风、川乌、川芎、当归、乳香、没药、红花、细辛）治疗OA 进行网络药理学预测。登录中药系统药理学数据库和分析平台，获取药物的有效化学成分，再根据化合物药代动力学特性，以类药性（Drug-likeneee, DL）≥0.18，分子量（Molecular Weight,MW）≤500，脂水分配系数对数值（AlogP）在1～3 之间并结合文献检索结果确定药物的活性化学成分。筛选获得了荣筋祛痹方中71种有效成分，利用STITCH、CTD 和Symmap 数据库搜索这些活性化合物在人体的潜在靶点，共对应421个靶点。按degree 值大小将排名靠前的有效成分与靶点基因做出关系图。见图8。

图8 荣筋祛痹方有效成分-靶点关系图

2.4.2 OA 的靶点预测 登录Genecards 数据库获取疾病靶点，以Osteoarthritis 为检索词，提取数据库中可信度较高（score≥5）的相关靶点2 072个。

2.4.3 荣筋祛痹方-OA 蛋白互作（PPI）网络的构建将421个药物候选靶点与2 072个OA 疾病靶点取交集，得到荣筋祛痹方治疗OA 的靶点52个，用R语言做出韦恩图。见图9。将“荣筋祛痹方”与“骨关节炎”的共同靶点导入STRING 数据库，限定物种为人，去掉网络中单一节点，其他参数不变，获取蛋白之间相互作用信息，结果保存tsv 格式并导入Cytoscape 3.7.2 软件绘制药物治疗OA 的PPI 网络图。见图10。依据度值大小与其相关排前10 的靶点依 次 为 HIF1A、PTGS2、FOS、CCND1、CASP8、MMP2、IL4、SPP1、CDKN1A、MAPK14。

图9 韦恩图

图10 荣筋祛痹方治疗OA 的PPI 网络

2.4.4 靶点基因功能富集分析 在DAVID 数据库中进行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 分析结果生物过程（BP）主要富集在氧化反应和老化反应等方面。见图11。GO 分析结果分子功能（MF）主要表现在细胞因子活性和受体-配体活性等方面。见图12。GO 分析结果细胞组分（CC）主要涉及质膜筏和细胞器外膜等方面。见图13。

图11 BP 分析

图12 MF 分析

图13 CC 分析

2.4.5 荣筋祛痹方作用的核心信号通路筛选 利用clusterProfiler 对上述方法筛选出的52个药物作用潜在靶点进行KEGG 信号通路富集分析，并筛选p.adjust＜0.05 的信号通路，结果共富集到94 条信号通路。结果显示，52个药物作用靶点主要分布于肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、白介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）和细胞凋亡（Apoptosis）等多个信号通路中，这表明荣筋祛痹方可以通过多条通路调控骨关节炎。见图14。

图14 KEGG 通路富集分析

3 讨论

在中医学中，与OA 相关的病名主要有“历节病、白虎病、鹤膝风”，该病属于“痹证、膝痛、骨痹”范畴[11]。中医学认为OA 的发病原因大多是由于肝肾亏虚、气血不足，以致风寒湿侵袭、气滞血瘀痰凝。据文献资料统计，目前我国OA 的临床治疗手段排名如下：中药方剂、外用中药进行关节冲洗、玻璃酸钠疗法、关节镜、针灸推拿、针刀、关节置换术等[13]。由此可见中医药在国内OA 的临床治疗中仍然占据主体地位[14～17]。目前OA 的中药外用治疗技术手段主要有敷贴、熏洗、熏蒸、热熨和离子导入等，手段多样，疗效显著，副作用较小[18～19]。根据管咏梅等[20]对2004～2015年OA 外用中药治疗的相关文献进行的频率、关联规则及聚类分析所得出的结论，高频药味及外用药方的处方治则应为活血化瘀、祛风除湿。

本研究拟利用中医辅助平台软件提供的改进互信息法、Kmens 算法 + 聚类、Kmens 算法 + 回归模拟三个数据挖掘方法，实现药物间关联性分析，从而聚类出核心组合，对清宫系列书籍用药组方的隐形经验进行进一步挖掘分析，旨在为OA 的中药外用治疗提供参考与依据。药味频次统计显示，祛风湿类药（综合解表药中的祛风除湿类药物）最多，用量最大，其次为补益药、活血化瘀类药物。故中药外用在OA 的临床治疗原则应为“祛风除湿、活血化瘀”，兼以补益肝肾。该原则是根据OA 的证候特点（痰湿、瘀血）及病机特征（肝肾亏虚、气血不足）确立的。从组方中药的性味归经而言，以性温平、味辛苦、归肝脾经的药物使用频次最多。以上高频用药来自诸多经典医著，结合经典与临床，可见中药外用治疗OA旨在对症治疗，缓急止痛。

聚类分析所得五类核心组合，大都以祛风湿、活血化瘀类药物为主。Ⅰ类当归、乳香、防风、羌活、大青盐、醋；Ⅱ类防风、当归、乳香、天麻、细辛、白芷；Ⅲ类牛膝、独活、羌活、木瓜、甘草、防风；Ⅳ类羌活、川乌、草乌、白鲜皮、红花、木瓜；Ⅴ类没药、乳香、当归、木瓜、红花、防风。以第Ⅴ类药为例，其中防风祛风止痛，而木瓜舒筋活络、胜湿除痹止痛，两者合用共奏祛风胜湿止痛之功。乳香、没药、红花发挥活血止痛的作用，再配伍当归既能补血又能活血，五药合用共奏祛风除湿、活血化瘀、补肝肾的功效。结合中药的性味归经发现其用药符合OA 内因肝肾亏虚、外感风寒湿邪、中间病理产物-血瘀的中医发病特点。因此基于清宫系列书籍的外用方中用药的数据分析聚类所得的核心组合是符合中医治疗骨关节炎的处方特点的，基于理论的分析能达到治疗OA 的作用，所以对今后临床用药具有一定的指导意义。

在核心组合符合用药规律的基础上，总结数据挖掘的结果，组合出新方，再采用网络药理学在微观水平来验证新方对骨关节炎的治疗效果，并在此基础上指导临床用药。网络药理学的分析结果可以看出，无论是从蛋白水平还是从细胞分子水平及信号通路的角度都证明了新方在理论上是对骨关节炎有治疗效果的。为进一步肯定新方的具体疗效，还需进行严谨的动物实验来加以验证。本研究是基于陈可冀主编之清宫系列书籍治疗OA 的用药组方规律研究，科学整理了本书治疗OA 常见用药规律与组方逻辑，利用现代数据挖掘技术，分析用药的关联规则及聚类，分析得出核心组方，再总结数据分析结果组合出荣筋祛痹方，并用网络药理学加以验证荣筋祛痹方治疗骨关节炎的可行性。利用数据挖掘来研究清宫系列书籍并非意味着对经典阅读的舍弃，而是利用现代技术对国医经典进行科学的归纳总结。本研究在一定程度上改进了传统医案学习的不足，但是对结果的正确判读仍然需要医者具备扎实的传统医学基础，并结合丰富的临床诊疗经验。