刺齿凤尾蕨中金雀异黄酮的提取与分离

2022-05-25张学晶段晨晨李春斌石玉生

大连民族大学学报 2022年1期

张学晶，车畅，段晨晨，李春斌，石玉生

(大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116605)

凤尾蕨科植物(Pteridaceae)全球约有10属，共400余种，广泛分布于热带地区和亚热带地区，热带美洲地区最多[1]。中国国内凤尾蕨科植物主要分布于西南及华南地区，少数种类向北到达华东及秦岭南坡。凤尾蕨属植物中大多含有黄酮及其苷类、二萜、倍半萜和多糖等多种类型化学成分，其中黄酮类成分能被人体迅速吸收，具有抗疲劳、保护血管、扩张毛细血管、防动脉硬化、抗脂肪氧化及抗衰老等功能[2]。现代药理研究表明黄酮类化合物具有显著的生理活性，如保肝、抑菌、抗癌、降血糖和降血脂等作用[3]。

国外学者对凤尾蕨属植物的研究较早，中国起步较晚。Murakami T等[4]从刺齿凤尾蕨中分离得到了5种二萜类化合物，对多种肿瘤细胞有抑制作用；1999年Lu等[5]从凤尾草中分离得到2种黄酮类化合物：芹菜素和木犀草素；张晓等[6]从半边旗中分离得到5种化合物，对多种癌细胞增殖有显著抑制作用；2013年，CHEN等[7]从剑叶凤尾蕨中分离得到倍半萜，对结核分枝杆菌具有抑制作用，表现出抗结核活性；2014年姚学军等[8]从凤尾草中分离得到2类二萜；2016年，张艳等[9]从剑叶凤尾蕨全草中分离得到8类二萜类化合物和2类倍半萜类化合物，并且细胞毒活性测试表明，其中的化合物crotonkinin E、crotonkinin F、pterisolic acid A和pterisolic acid C具有一定抑制人结肠癌细胞HCT-116、肝癌细胞HepG2和人胃癌细胞BGC-823的活性；2017年，孙丹等[10]从刺齿凤尾蕨中分离得到5种二萜类化合物，可显著抑制人源结肠癌细胞活性；周艳丽等[11]在刺齿凤尾蕨中分离得到10类化合物，发现其中3类化合物对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有较强的保护作用。

刺齿凤尾蕨(Pteris dispar Kunze)，别名刺齿半边旗[12]，为凤尾蕨科凤尾蕨属药用植物，具有清热解毒、止血祛痰的功效[10]，民间常用于治疗肠炎、痢疾、疮毒及妇科疾病[13]。刺齿凤尾蕨的提取物对多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用[14,15]。刺齿凤尾蕨提取物对人癌细胞具有明显抑制作用。近年来研究者从剑叶凤尾蕨、岩凤尾蕨、半边旗等多种凤尾蕨属植物中分离并鉴定了多种具有抗肿瘤活性的贝壳杉烷型二萜类化合物。而对刺齿凤尾蕨较少进行系统的化学成分及生物活性研究。根据药用植物亲缘学原理，亲缘关系相近的植物一般含有结构相似的化学成分，而结构相似的化合物一般具有相似的生理活性。为从凤尾蕨属植物中寻找更多更有效的活性成分，选择刺齿凤尾蕨作为研究对象，设计实验方案进行提取与制备，以期发现活性较强、含量较高的萜类化合物以及黄酮类化合物。

1 仪器与材料

1.1 试验仪器

200 L提取浓缩机组(北京中联台电机械有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，高效液相色谱仪(日本岛津)，半制备等度液相色谱(北京赛诺华博科技有限责任公司)，分析色谱柱(Agela Technologies)半制备色谱柱(Agela Technologies)，核磁共振仪(美国Varian公司)。

1.2 试验材料

刺齿凤尾蕨采集于广东湛江市廉江市塘蓬镇，鉴定为刺齿凤尾蕨全草。

本实验中用到的无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为分析纯，甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)、三氟乙酸(Avantor Performance Materials)为色谱纯，水为双蒸水。聚酰胺树脂(14～30目)，ODS C18(50 μm，60 A)。

2 试验方法

2.1 刺齿凤尾蕨的提取与萃取

刺齿凤尾蕨全草(10 kg)晾干，用粉碎机粉碎后经95%乙醇溶液浸泡4 h，加热回流提取3次，每次3 h，回收后得到浸膏1.1 kg。浸膏用少量水分散溶解，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚萃取收集上清液得石油醚萃取物(540 g)；用二氯甲烷萃取，收集下层萃取液得，二氯甲烷萃取物(100 g)；用乙酸乙酯萃取，收集上清液得乙酸乙酯萃取物(90 g)，再用正丁醇萃取，取上清液，得正丁醇萃取物(45 g)。

2.2 聚酰胺树脂柱色谱分离

二氯甲烷萃取物用聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30%、60%、95%)进行梯度洗脱，减压回收各组分得到水洗脱物(26 g)、30%乙醇洗脱物(17 g)、60%乙醇洗脱物(10 g)和95%乙醇洗脱物(7 g)四个部位(Fr.A～Fr.D)。

2.3 中压制备液相色谱分离

将聚酰胺树脂柱色谱分离得到的Fr.A用中压制备液相色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，甲醇浓度变化梯度为5%，变化范围5%～80%。500 ml为一个组分，共得55个组分(Fr.1～Fr.55)。

Fr.16组分用全波长高效液相色谱进行检测分析，通过半制备HPLC用甲醇:水为35:65，作为流动相分离得到化合物X(6.8 mg)。

3 化合物结构鉴定

化合物X：白色粉末；1H NMR(600 MHz，CD3OD) δ:8.05 (1H，s，H-2)，7.37 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，6′)，6.84 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.34 (1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.22 (1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，13C NMR(CD3OD，150 MHz) δ:182.55 (s，C-4)，166.26 (s，C-7)，164.16 (s，C-5)，160.02 (d，C-2)，159.12 (s，C-9)，155.09(s，C-4′)，131.67 (d，C-2′，6′)，125.03 (s，C-3)，123.60 (s，C-1′)，116.55 (d，C-3′，5′)，106.58 (s，C-10)，100.40 (d，C-6)，95.06(d，C-8)。将其核磁数据与文献[16]对照，鉴定化合物为4′,5,7-Trihydroxyisoflavone，金雀异黄酮。

化合物X结构如图1。