鸟分枝杆菌复合群对氯法齐明、贝达喹啉和德拉马尼的药物敏感性

王晨倩 王桂荣 姜广路 霍凤敏 薛毅 黄海荣 段鸿飞

1首都医科大学附属北京胸科医院结核科（北京 101149）；2首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，国家结核病临床实验室，北京市耐药结核病研究重点实验室（北京 101149）

非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）系指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的统称［1］。NTM 病是指由NTM 感染引起的肺病及肺外疾病。近年来，NTM 病在全球范围内呈快速增长趋势［2］，其中，包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的鸟分枝杆菌复合群（Mycobacteriun aviumcomplex，MAC）在绝大多数国家地区是引起NTM 病最常见的病原体［3］。目前指南［1］推荐MAC 肺病的标准治疗方案是以大环内酯类药物（克拉霉素或阿奇霉素）为核心，联合利福平（或利福布汀）、乙胺丁醇和阿米卡星，但Meta 分析显示其治愈率很低，仅有60%～69%［4-6］。因此，寻找标准治疗方案之外的高效抗MAC 药物迫在眉睫。

近年来，氯法齐明（clofazimine，CFZ）、贝达喹啉（bedaquiline，BDQ）和德拉马尼（delamanid，DLM）这三种药物对NTM 展现出了较好的抑菌活性而备受瞩目，但我国关于MAC 对这三种药物敏感性的报道较少。因此，本研究通过比较分析氯法齐明、贝达喹啉和德拉马尼对MAC 临床分离株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），初步评估其对MAC 肺病的治疗价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株93 株试验菌株均收集于首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室样本库，其中胞内分枝杆菌临床分离株81 株，鸟分枝杆菌临床分离株12 株。菌株自患者呼吸道标本中分离出来，可以在含有对硝基苯甲酸的中性改良罗氏培养基（珠海银科医学工程股份有限公司）上生长的细菌初步鉴定为NTM，之后通过在Gen-Bank 分析比对同源序列16S rRNA 编码基因、热休克蛋白65（hsp65）编码基因、16S-23S rRNA 基因间区（ITS）和RNA 聚合酶β 亚基（rpoB）鉴定至种水平。实验使用的标准菌株为ATCC13950（胞内分枝杆菌标准株）和ATCC25291（鸟分枝杆菌标准株）。

1.1.2 抗感染药物及溶剂氯法齐明（上海瀚香生物科技有限公司）、贝达喹啉（上海瀚香生物科技有限公司）、德拉马尼（上海瀚香生物科技有限公司），均由二甲基亚砜（美国Sigma 公司）作为溶剂，分别配置成浓度为4 mg/mL、4 mg/mL、16 mg/mL的药液。

1.2 方法

1.2.1 MIC 测定采用微孔板Alamar Blue 法（microplate alamar blue assay，MABA）。选取在中性改良罗氏培养基上生长3～4 周的新鲜菌落，磨菌，将菌悬液比浊至0.5McFarland，再用MH 培养基将0.5McFarland 的菌悬液稀释至（1～5）×105CFU/mL备用。在96孔板每孔加入100 μL的MH培养基，在第12 列加入稀释好的药物（贝达喹啉1 μg/mL、氯法齐明4 μg/mL、德拉马尼鸟分枝杆菌16 μg/mL、德拉马尼胞内分枝杆菌2.048 mg/mL），吹打混匀后由第12 列吸出100 μL 至下一列吹打混匀，以此类推倍比稀释至第2 列，将最后100 μL 弃掉。最后向每孔加入备好的菌液100 μL。此时，第一列为不加药物只有菌液和培养基的对照孔，第12 列为最高药物浓度（贝达喹啉0.25 μg/mL、氯法齐明1 μg/mL、德拉马尼鸟分枝杆菌4 μg/mL、德拉马尼胞内分枝杆菌512 μg/mL）。将96孔板放置于37 ℃温箱孵育9～10 d后，在每孔加入20 μL Alamar blue和50 μL 5% Tween80，37 ℃孵育24 h 后读取结果。如液体颜色变为粉红色则表明有菌落生长，为蓝色则表明无菌落生长，按相应孔颜色的变化读取实验结果并记录。

1.2.2 流行病学临界值（ECOFF）的确定使用ecoffinder-xl-2010-v21-webversion 软件（美国临床和实验室标准协会CLSI）计算相应的MIC50、MIC90及ECOFF 值。

2 结果

2.1 氯法齐明对MAC 的MIC 和ECOFF 值氯法齐明对胞内分枝杆菌的MIC 范围分布广，为0.015 6～0.5 μg/mL，MIC50和MIC90分别为0.25 μg/mL和0.5 μg/mL，ECOFF 值为0.5 μg/mL（表1，图1）；氯法齐明对鸟分枝杆菌的MIC50和MIC90分别为0.25 μg/mL 和0.5 μg/mL，ECOFF 值为0.5 μg/mL（表1，图2）。

图1 氯法齐明对胞内分枝杆菌临床分离株的MIC 值分布Fig.1 The MIC distribution of clofazimine against M.intracellulare clinical isolates

图2 氯法齐明对鸟分枝杆菌临床分离株的MIC 值分布Fig.2 The MIC distribution of clofazimine against M.avium clinical isolates

表1 氯法齐明和贝达喹啉对MAC 临床分离株的MICTab.1 The MICs of clofazimine and bedaquiline against MAC clinical isolates μg/mL

2.2 贝达喹啉对MAC的MIC和ECOFF值贝达喹啉对胞内分枝杆菌的MIC范围分布广，为0.007 8～0.25 μg/mL，MIC50和MIC90分别为0.125 μg/mL和0.25 μg/mL，ECOFF值为0.25 μg/mL（表1，图3）；贝达喹啉对鸟分枝杆菌的MIC 范围为0.015 6～0.062 5 μg/mL，75%（9/12）的鸟分枝杆菌的MIC 均为0.062 5 μg/mL，MIC 为0.015 6 和0.031 3 μg/mL的胞内分枝杆菌分别有1 和2 株（表1，图4）。

图3 贝达喹啉对胞内分枝杆菌临床分离株的MIC 值分布Fig.3 The MIC distribution of bedaquiline against M.intracellulare clinical isolates

图4 贝达喹啉对鸟分枝杆菌临床分离株的MIC 值分布Fig.4 The MIC distribution of bedaquiline against M.avium clinical isolates

2.3 德拉马尼对MAC的MIC德拉马尼对胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的MIC 均较高：91.7%（11/12）的鸟分枝杆菌的MIC 均为＞4 μg/mL，MIC 为≤0.004 μg/mL 的胞内分枝杆菌仅有1 株；97.5%（79/81）的胞内分枝杆菌的MIC ≥256 μg/mL，MIC 为≤0.5 μg/mL 和4 μg/mL 的胞内分枝杆菌各有1 株。

3 讨论

虽然指南推荐了MAC 肺病的标准治疗方案，但有一些因素影响了治疗效果，导致治愈率较低。一是如果患者使用浓度受利福霉素影响的药物，会影响基础疾病的治疗。高龄是NTM 肺病的易感因素，且高龄NTM 肺病患者合并心脑血管基础疾病的人数也较多，而MAC 肺病标准治疗方案中的利福霉素是肝药酶P450 强诱导剂，会降低抗凝药（如利伐沙班）、降压药（如氨氯地平）和降糖药（如格列齐特）的药物浓度［7-9］。二是高龄患者使用阿米卡星存在较高的肾毒性和耳毒性风险。三是既往抗结核治疗史影响MAC 肺病的疗效。在我国，肺结核为常见病，而MAC 肺病实验室检查也可以发现抗酸染色阳性和分枝杆菌培养阳性，导致一部分MAC 肺病患者在确诊前已经接受了抗结核治疗，予MAC 肺病标准方案可能形成事实上大环内酯单药治疗MAC 肺病，造成治疗失败。因此，有必要探索新的MAC 肺病治疗药物。

MAC 对多数抗分枝杆菌药物耐药的原因之一在于其细胞壁为疏水性，药物不易透过。但氯法齐明为亲脂性化合物，可以自由透过MAC 的细胞壁，破坏细菌的细胞壁［10］。氯法齐明通过与分枝杆菌DNA 结合抑制RNA 聚合酶，阻止RNA 合成，进而抑制蛋白质的合成发挥抗菌作用。体外试验显示氯法齐明对MAC有良好抑菌效果。KWAK 等［11］的研究显示氯法齐明对MAC 的MIC 分布范围广，为0.031～8 mg/L。KIM等［12］研究显示，氯法齐明对鸟分枝杆菌的MIC50和MIC90分别为0.125 μg/mL 和0.25 μg/mL，对胞内分枝杆菌的MIC50和MIC90均为0.25 μg/mL。在LUO 等［13］研究中，鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌临床分离株的氯法齐明ECOFF 值分别为1 μg/mL 和2 μg/mL。HUANG 等［14］研究结果指出，氯法齐明对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC 范围分别为1～4 mg/L、≤0.25～8 mg/L。此外，体外实验还显示氯法齐明与阿米卡星、克拉霉素、利奈唑胺、乙胺丁醇和贝达喹啉具有协同作用［15-19］。临床研究显示，大环内酯联合氯法齐明治愈率高于大环内酯联合利福平治愈率（100%vs.71%，P=0.000 2）［20］。

贝达喹啉是一种新型二芳基喹啉类口服抗生素，可以选择性抑制ATP合酶质子泵以干扰能量产生，使ATP 耗竭，导致细胞死亡而发挥杀菌作用［21］。在LITVINOV 等［21］的研究中，贝达喹啉对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC50、MIC90、ECOFF值分别为0.015、0.12、0.12 μg/mL 和0.007、0.06 、0.06 μg/mL。KIM 等［22］研究显示，贝达喹啉对MAC临床分离株的MIC50和MIC90均为≤0.016 μg/mL。PANG 等［23］研究指出，贝达喹啉对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC50均为0.03 μg/mL，ECOFF均为1 μg/mL。SONI 等［24］的研究结果显示，贝达喹啉对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC 范围分别为0.03～0.13 μg/mL 和0.03～0.25 μg/mL。

与以上研究相比，本研究中氯法齐明对MAC的MIC 偏低，贝达喹啉对MAC 的MIC 则偏高，这可能是由于地域差异和实验方法的不同引起的。比如HUANG等［14］、KWAK等［11］和LITVINOV等［21］收集的菌株分别是来自中国台湾、韩国和俄罗斯地区，而本研究中的菌株主要来源于中国北方地区。SONI 等［24］采用的是琼脂稀释法，而本实验采用的是肉汤稀释法。

与氯法齐明和贝达喹啉相比，德拉马尼对MAC 无明显抑制作用。KIM 等［22］研究指出，德拉马尼对MAC 的MIC 值很高，对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC50分别为8 μg/mL 和16 μg/mL，对MAC 的MIC90均为＞16 μg/mL。在YU 等［25］的研究中，德拉马尼对94.4%（34/36）胞内分枝杆菌临床分离株的MIC ≥32 μg/mL。而在本研究中，德拉马尼对胞内分枝杆菌的MIC 更高，97.5%（79/81）胞内分枝杆菌临床分离株MIC ≥256 μg/mL，造成这一差异的原因可能是药敏试验中设置的药物最高浓度不同，在本实验中，胞内分枝杆菌的德拉马尼药物浓度范围是0.5～512 μg/mL，最高浓度远高于以往试验。

本研究存在如下局限性：最主要的是鸟分枝杆菌临床分离株的样本量过小，可能会导致结果出现偏差。其次，鉴于在MAC 临床分离株收集前，患者均未使用过贝达喹啉、氯法齐明及德拉马尼，所以暂时认为这批菌株均为“野生型”。但是，在确定MAC 药敏试验的临界值时，还应该包括已经暴露于给定药物的菌株，而本研究中未收集该类菌株，也会导致获得的临界值不能完全代表广泛的MAC 菌株。

尽管本研究结果显示出MAC 对氯法齐明、贝达喹啉在体外有较高的敏感性，但在药代和药动学方面的研究不够充足，药物之间的相互作用也未深入研究。因此，如何将氯法齐明、贝达喹啉更好地用于MAC 肺病的治疗，还需要进一步的研究。