初治肺结核患者与健康人群呼吸道细菌与真菌微生态比较

黄业伦 刘志辉 张院良 康晓明 林媛 吴碧彤 蔡杏珊

广州市胸科医院呼吸疾病国家重点实验室（广州 510095）

微生物是人类密不可分的“伙伴”，人体口腔、呼吸道、皮肤、胃肠道、泌尿生殖道等存在大量的微生物，总数可达10 万亿～100 万亿，微生物群对人体有营养作用、参与人体的代谢作用、对外来微生物有“生物拮抗”作用、有免疫屏障与免疫刺激作用，对机体的生长发育和衰老有重要作用，长期与机体处于动态平衡中。不少研究表明慢性呼吸道疾病的菌群屏障功能受损，外源性病原体大量侵入或内源性病原体大量生长，微生态失衡与疾病相关［1-3］。肺结核病（pulmonary tuberculosis，PTB）是一种古老的呼吸道传染病，病原菌是外来的结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB），MTB 从呼吸道入侵到肺部定植，引起一系列的人体免疫反应，包括免疫细胞的聚集吞噬、炎症损伤、黏液分泌、纤毛清除作用、局部温度、氧含量、pH 值等变化，以及对呼吸道的微生态的影响。为此，本项目采用培养方法探讨初治肺结核患者呼吸道分泌物的细菌、真菌的微生态变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2019年至2020年到本院就诊的70 名结核病初治患者作为观察组，38 名健康医务人员及医学院学生作为对照组。两组的年龄均为20～60 岁，观察组男48 例，女22 例；对照组男20例，女18例。观察组患者痰涂片找抗酸杆菌阳性，Gene Xpert MTB/RIF 核酸检测鉴定为MTB，入组时未使用抗结核治疗，后期的痰培养鉴定为MTB。观察组排除标准：（1）合并严重系统性疾病、恶性肿瘤等；（2）理解能力有限或不能配合检查者。对照组无呼吸系统慢性疾病史，无心、肺、脑及其他疾病，X 线胸透无异常。所有受试对象均知情同意。

1.2 试剂与仪器MS 质谱仪购于法国梅里埃公司；质谱使用基质液、甲酸、乙腈购自梅里埃公司，血平板、麦康凯平板、巧克力平板、科玛嘉真菌显色平板购自广州市迪景公司，罗氏培养基购自珠海贝索公司。

1.3 实验方法

1.3.1 留取检测标本采用吸入超声雾化3%盐水的方法留取38 例对照组人群的呼吸道诱导痰，另外分别采集70 位TB 患者在初治期的清晨深呼吸痰。

1.3.2 细菌与真菌的培养

1.3.2.1 普通细菌与真菌培养采用5 μL 接种环分别挑取一环痰标本接种在血平板、巧克力平板、麦康凯平板、科玛嘉真菌显色平板进行4 区划板半定量需氧、厌氧、真菌培养［4］。

1.3.2.2 分枝杆菌培养加入2 mL 痰液与4 mL 4%氢氧化钠震荡混匀，静止15 min 后吸取0.2 mL混悬液接种到罗氏培养基里进行培养［5］。

1.3.3 菌种鉴定培养阳性菌株根据平板上菌落的大小、凹凸形态、干燥或湿润程度、黏稠程度，溶血程度，以及利用选择培养基的菌落的不同颜色、菌落边缘的不同形态进行初步判断，然后分类挑取单个菌落采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectromentry，MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定。具体操作见生物梅里埃公司的MALDITOF MS 说明书。

1.3.4 菌落密度计数对鉴定出来的菌种：普通细菌、酵母菌、丝状真菌按4 区划线标准进行计数：只在平板上第一区生长，菌落数为：104CFU/mL；能在第二区生长，且该区菌落数小于5，菌落数为：105CFU/mL；能在第三区生长，且该区菌落数小于5，菌落数为：106CFU/mL；能在第三区生长，且该区菌落数大于5，菌落数为：107CFU/mL。分枝杆菌的菌落计数为：培养基上的菌落数乘以稀释倍数15。

1.4 统计学方法用统计学软件SPSS 20.0 对检测数据进行统计学分析，细菌密度数值以均数±标准差表示，并以log 10 换算出来表示，正态分布计量资料采用成组t检验，偏态分布资料秩和检验，率的比较采用χ2检验计算，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 门水平的细菌及真菌检出情况观察组70份呼吸道样本与对照组38 份呼吸道样本分别培养，在门的水平上，两组人群主要检出细菌的五大菌门：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门，另检出真菌的子囊菌门和担子菌门（担子菌门检出菌株少于1%，不纳入计算）。观察组在放线菌门的检出率比对照组低，在子囊菌门的检出率比对照组高（P＜0.05）；从菌群的密度来看，观察组在厚壁菌门、放线菌门、子囊菌门的细菌密度比HG 高，在梭杆菌门的密度比HG 低，经T 检验计算差异有统计学意义（P＜0.05），见表1-2（观察组在放线菌门的数据统计剔除结核分枝杆菌病原菌）。

表1 按”门”分析观察组和对照组气道细菌与真菌微生物检出情况Tab.1 Detection in Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons例（%）

2.2 种水平与属水平的微生物检出情况本次实验培养出67 个菌种，其中两检测组共同检出菌种有32 种，观察组独有26 种，对照组独有9 种，观察组与对照组单独检出菌种的检出率均低于25%。对于任一组检出率大于50%的菌株：口腔链球菌/缓症链球菌、奈瑟菌、小韦荣球菌/不典型韦荣球菌、粘滑罗斯菌、副流杆嗜血杆菌、产黑色素普雷沃菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌和口腔纤毛菌，以上菌种在观察组和对照组的检出率分别为：95.71%vs.100%、91.43%vs.100%、61.43%vs.71.05%、60.00%vs.86.84%、58.57%vs.94.74%、45.71vs.68.42%、38.57%vs.60.53%和44.29%vs.57.89%，是两实验组共同的优势菌种，见表3、4。

表2 按”门”分析观察组和对照组气道细菌与真菌密度情况Tab.2 Colony forming unitin Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons ±s

表2 按”门”分析观察组和对照组气道细菌与真菌密度情况Tab.2 Colony forming unitin Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons ±s

组别观察组对照组t 值P 值拟杆菌门5.48±5.62 5.78±5.12 1.175 0.261厚壁菌门6.81±6.65 6.29±6.45-2.338 0.021变形菌门6.41±5.74 6.56±6.63 1.176 0.243放线菌门5.5±5.65 5.09±5.16-2.388 0.024梭杆菌门4.79±4.68 5.33±5.50 2.104 0.033子囊菌门6.01±5.85 3.4±3.53-2.835 0.007

表3 依检出样本比例按菌种分析结核病患者（TB）和健康组（HG）气道细菌与真菌微生物检出情况Tab.3 Detection rate in Speciesof bacteria and fungi in Airways of patients with tuberculosis and healthy people 例

3 讨论

结核病是呼吸道慢性传染病，2020年，全球有150 万例因此死亡［6］，引起PTB 发生的病原菌已经明确是MTB，但MTB 入侵肺部所引起的呼吸道微生态变化并未明确。本项目发现PTB 初治组与健康组检出细菌的五大菌门：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门，另检出真菌的子囊菌门和担子菌门，是呼吸道的常见菌门，与多数研究一致［7-9］。

观察组在放线菌门的检出率比对照组低22.1%，主要是罗斯菌属的检出率降低。罗斯菌属为呼吸道的正常菌群，在健康人的呼吸道中与其它菌属构成呼吸道的生物膜物理屏障，占据黏膜位置拮抗外来致病菌，PTB 患者因机体对MTB清除的免疫机制误伤正常菌群，不少的研究也发现了这个现象［8］。观察组在子囊菌门的检出率比对照组高38.5%，主要是酵母样菌和丝状真菌的升高。在结核病合并感染的许多研究中发现，由于MTB 在肺中形成肉芽肿，进而破坏肺组织形成空洞或肺损伤利于真菌的定植［10］。

从菌群密度来看，观察组在厚壁菌门、放线菌门、子囊菌门的细菌密度比HG 高，在梭杆菌门的密度比HG 低。这表明结核病患者呼吸道菌群的生长繁殖相对于健康人群发生了变化。不少的研究也证实了PTB 患者呼吸道菌群紊乱，相对丰度发生变化［1，7-9，11］。

表4 结核病患者（TB）与健康组（HG）气道细菌与真菌微生态构成比较Tab.4 Comparison of microecological composition of bacteria and fungi in respiratory tract between patients with tuberculosis and healthy people

两检测组共同检出32 种菌种，检出率大于25%的菌种都属于共同检出菌，特别是检出率大于50%的菌种，如口腔链球菌/缓症链球菌、奈瑟菌、小韦荣球菌/不典型韦荣球菌、粘滑罗斯菌、副流感嗜血杆菌等均为口咽部延续到下呼吸道的常见优势菌种，与CHEUNG 等［11］及SUNG 等［12］团队的研究相近，也表明了PTB 的发生没有影响呼吸道优势菌。

观察组单独检出26 种菌种，对照组独有9 种，数据表明观察组的呼吸道菌群比健康人群有更多的多样性，表现在观察组检出特有的非结核分枝杆菌及丝状真菌，且检出更多的条件致病菌，有一定的合并感染危险性，与CUI 等［8］的报道结果相近。但也有研究［11］表明两者的多样性差异无统计学意义，估计与研究的人群、地域、环境等因素的不同相关。检出率低于25%的菌种，属于难以培养的呼吸道菌群以及本来就少量存在的条件致病菌，如肠杆菌科细菌、非发酵菌、金黄色葡萄球菌、非结核分枝杆菌、酵母样菌、丝状真菌菌等，观察组培养出47 个菌种，对照组培养出30 个菌种，再次表明观察组菌群的多样性增加。

呼吸道菌群包括细菌、真菌、病毒，在正常情况下与人体互惠互利，菌群及其代谢产物参与机体的免疫调节、微量元素补充等，同时有防御致病菌入侵的功能。不少的研究表明呼吸道菌群紊乱与PTB 有关［1，7-9，11］。本文的数据同样发现PTB 患者呼吸道菌群紊乱，条件致病菌菌种增多，部分正常菌群被拮抗减少。据此推测：当机体免疫功能异常时，机体对外来菌的清除能力下降，打破了微生物迁入与清除的平衡，呼吸道的pH 值、氧含量、温度、营养等发生了改变，外来菌更适宜生长繁殖，而且对定植的正常菌群起到拮抗作用，与此同时，机体对外来菌强烈的免疫清除作用也对正常菌群造成损伤，反之亦然。综上所述，PTB 的发生不仅仅与MTB 病原菌有关，呼吸道的菌群种类、密度变化与机体的免疫反应也参与了这个过程的发生，在后续的抗结核治疗当中，董文雅［13］发现HRZE 治疗可改变肺结核患者痰液菌群的整体多样性及菌群结构，所以在快速有效杀灭MTB 菌的同时，应关注呼吸道菌群的变化，以免引起细菌与真菌的合并感染。

本文的研究存在局限性，呼吸道的微生物种类繁多，仅仅采用有限的几种培养基孵育细菌真菌，尚有部分菌属不能培养出来，且在挑选菌落时有些偏倚，未能全面检出菌属。但是结合需氧、厌氧、真菌和分枝杆菌培养等多种方式孵育菌株，MALDI-TOF 技术鉴定，虽然无法媲美于16s rRNA和ITS 测序法的海量菌种，但也能培养出呼吸道的常见优势菌种，同时筛选出条件致病菌和病原菌，这是测序法无法比拟的［14］，直观、肉眼可见的菌落和试剂成本低也是培养法的优点［12］。

本文的研究尚未全面，且研究的数量也未足够大，在后续的研究中将加大样本量在各种类菌属密度上以及在代谢与免疫应答方面深入研究，探索微生态的奥秘，为PTB 的防治提供科学的数据。