中国南方地区结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药特征分析

王楠 邓丽 牛群 吴玲 雷杰 谢贝 杨瑜 李华 刘志辉 孟繁荣

广州市胸科医院肺部疾病研究所（广州 510095）

吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）可杀灭巨噬细胞内或微酸性环境中非复制性结核分枝杆菌，在耐药和敏感结核患者抗结核治疗中均发挥了重要作用。PZA 发挥抗结核作用需要酸性环境［1-2］（pH 5.5），而结核分枝杆菌最适生长pH 为6.5～6.8。有研究表明［3］与pH 6.8 相比，在pH 5.5 的酸性环境中有50%以上的结核菌生长受到抑制，有些菌株则根本不能生长。鉴于此结核菌体外PZA 药敏试验的敏感性和特异性有限，不及其他抗结核药物成熟。目前MGIT 960 分枝杆菌检测系统是WHO认可的PZA 敏感性的标准检测方法。而该方法所需仪器设备、试剂昂贵难以在基层全面开展，也因此关于结核分枝杆菌PZA 药敏性的信息不及其他一线抗结核药物全面。我院自2012年开展MGIT 960 PZA 药敏试验，约60%以上的结核分枝杆菌培养阳性患者接受PZA 药敏检测。对就诊于本院结核患者的结核分枝杆菌PZA 耐药状况分析发现，其他一线抗结核药物组合耐药可能影响结核分枝杆菌PZA 耐药率。基于此，本研究分析了2012-2018年就诊于我院结核患者的PZA 耐药特征，旨在了解本地区PZA 耐药结核病的流行状况，进一步探讨可能影响结核分枝杆菌PZA 耐药的重要因素，为结核分枝杆菌PZA 耐药机制的揭示提供研究基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料分枝杆菌生物样本信息库中选取PZA 和异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素（以下分别简称为H、R、E、S）药敏信息齐全的结核分枝杆菌临床分离株，菌株分离自2012年11月至2018年12月就诊于我院的结核患者。菌株包括H、R、E和S 全部敏感菌株5 752 株，及对上述四种药物中任意一种及以上耐药的菌株3 574 株。

1.2 分组依据结核分枝杆菌对H、R、E 和S 耐药数量的不同分为4 组：耐1 药（1 372 例）、耐2 药（865 例）、耐3 药（797 例）和耐4 药（540 例）；依据结核分枝杆菌是否出现R耐药分为R耐药（791例）和R 敏感（1 008 例）组；依据结核分枝杆菌对H、R、E 和S 耐药组合不同分为16 组：Q（5 752 例）、S（731 例）、H（440 例）、E（66 例）、R（135 例）、SE（14 例）、RS（50 例）、HS（423 例）、RE（16 例）、HR（327 例）、HE（35 例）、HSE（66 例）、RSE（8 例）、HRS（552 例）、HRE（171 例）、HRSE（540 例）。

1.3 统计学方法以Excel 表格公式计算不同耐药组合结核分枝杆菌的PZA 耐药率；以SPSS 26.0进行χ2检验，分析比较一线抗结核药物耐药组合不同及利福平耐药特征不同的结核分枝杆菌临床分离株PZA 耐药率差异，以P＜0.05/n（n 为组间比较次数）表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐0、1、2、3、4 种药物结核分枝杆菌PZA 耐药率及其组间差异比较耐0、1、2、3、4 种其他一线抗结核药物结核分枝杆菌PZA 耐药率结果示，任意两组组间PZA 耐药率差异有统计学意义（P＜0.005）。见表1。

表1 一线抗结核药物耐药数量不同结核分枝杆菌的PZA 耐药率Tab.1 PZA resistance rates of MTB with resistance to different numbers of first-line drugs

2.2 利福平（RFP）耐药和RFP 敏感结核分枝杆菌PZA 耐药率及其组间差异比较RFP 耐药和敏感的结核分枝杆菌PZA 耐药率为分别为56.03%和12.51%，两组PZA 耐药率差异有统计学意义（P＜0.05）；RFP 耐药耐1（RFPR1）、2（RFPR2）、3（RFPR3）、4（RFPR4）种药物及RFP 敏感耐1（RFPS1）、2（RFPS2）、3（RFPS3）种药物结核分枝杆菌的PZA 耐药率比较，7 组结核分枝杆菌PZA 耐药率差异显示：RFPR1与RFPS2、RFPR2与RFPS3、RFPR3与RFPS3组间比较差异无统计学意义（P＞0.002），余者任意两组间比较差异有统计学意义（P＜0.002）。见表2。

表2 RFP 耐药表型不同结核菌的PZA 耐药率Tab.2 PZA resistance rates of MTB with different RFP resistance phenotypes

2.3 H、R、S、E 的16 种耐药组合结核分枝杆菌的PZA 耐药率及组间差异比较H、R、E 和S 的16种耐药表型组合耐药菌与全敏菌组间PZA 耐药率差异显示：S、E、SE 耐药菌与全敏菌的PZA 耐药率差异无统计学意义（P＞0.003），余者组间比较，差异有统计学意义（P＜0.003）。见表3。

表3 一线抗结核药物耐药组合不同结核分枝杆菌PZA 耐药率Tab.3 PZA resistance rates of MTB with different backgrounds of resistance to first-line anti-tuberculosis drugs

3 讨论

PZA 作为目前唯一可杀灭非复制性持留菌的抗结核药物，与RFP 和INH 联合在缩短抗结核治疗疗程及耐药和敏感结核治疗中均发挥了重要作用［4-7］。受限于PZA 发挥抗结核作用需要微酸性环境（pH 约为5.5），加之其药敏性检测标准方法难以普及，因此对结核患者的PZA 耐药状况的了解不如其他几种一线抗结核药物全面深入。我院自2012年以来应用MGIT 960 分枝杆菌检测系统开展结核分枝杆菌PZA 药敏检测，基于此，本研究分析了2012-2018年间就诊于我院结核患者中有PZA 药敏信息者的PZA 耐药特征，旨在了解本地区PZA 耐药结核病流行状况、分析可能影响结核分枝杆菌PZA 耐药的主要因素，为结核分枝杆菌PZA 耐药机制的进一步阐明提供研究基础。

本研究发现我国南方地区结核患者总体PZA耐药率约为15.51%，与其他结核病高负担国家PZA耐药率相近［8-10］，我国2010年结核病流行病学抽样调查也显示PZA 耐药率约为15%［11］。而德国和韩国结核患者PZA耐药率则分别为1.6%和3.1%［12-13］，可见不同国家地区PZA耐药结核病流行状况不同。但耐多药结核患者中PZA 耐药者的流行状况普遍较为严峻：目前全球超过50%的耐多药结核患者对PZA 耐药［14］。不同国家和地区略有不同：非洲［15］（54%）、印度［16］（57.8%）、秘鲁［17］（47.7%）、韩国［18］（35.7%）、重庆［19］（62.4%）、杭州［20］（55%）、河南［21］（69.08%），本地区耐多药结核患者PZA 耐药率为60.69%。在非耐多药结核患者中PZA 耐药状况不同国家地区亦有所不同，巴基斯坦、乌干达、坦桑尼亚结核患者PZA 耐药率分别为14.8%［8］、21%［9］、20%［10］，本地区非耐多药结核患者PZA 耐药率为6.22%。

耐多药结核患者PZA 耐药率普遍高于非耐多药者，而超过90%的利福平耐药者为耐多药。众所周知，结核分枝杆菌rpoB 基因编码RNA 聚合酶β 亚基，其突变影响利福平与其表达产物的结合从而产生耐药。RNA 聚合酶在蛋白质转录翻译中发挥重要作用，可能会影响结核分枝杆菌的代谢。PZA 为前体药物，其发挥抗结核作用需要PZA 酶催化为活性形式吡嗪酸。PZA 酶是PZA 发挥抗结核作用中重要的蛋白，rpoB 基因突变导致的RNA 聚合酶β 亚基改变是否会影响到PZA 酶的转录表达尚未见报道。本研究发现利福平耐药结核患者的PZA 耐药率显著高于利福平敏感者，由此猜想，利福平耐药可能从影响PZA 酶的转录翻译方面对结核分枝杆菌的PZA 耐药产生影响。以此科学假说指导后续PZA 耐药机制的研究，如有所发现或可为结核分枝杆菌PZA 耐药机制的全面揭示提供理论基础。此外RFP 耐药结核菌中随着其他抗结核药物耐药数量的增多PZA 耐药率显著升高，PZA 耐药率的这种变化是否与一线抗结核药物组合耐药相关需要进一步的研究予以探索。

对其他抗结核药物耐药对结核分枝杆菌PZA耐药的影响分析发现：一线抗结核药物耐药组合不同的结核分枝杆菌PZA 耐药率不同，与KHAN等［22］和CHE 等［23］研究相似。此外，S 和E 单独及同时耐药菌与全敏菌的PZA 耐药率均无显著差异，提示此两种药物可能并非影响结核分枝杆菌PZA 耐药的主要因素。与本研究不同，LIN 等［24］研究发现在福建PZA 耐药结核菌中S 和E 耐药率明显较高。本研究发现利福平和异烟肼单独耐药结核菌之间PZA 耐药率无显著差异，两者是否共同影响结核菌PZA 耐药需要进一步探索研究。鉴于SE、RE 和RSE 耐药菌株均不足20 株，本研究的分析尚不足以确定S 和E 是否会与利福平或异烟肼联合影响结核菌PZA 耐药。

综上分析，利福平和异烟肼可能是影响本地区结核菌PZA 耐药的主要因素。关于我国南方地区结核菌的PZA 耐药，HAMEED 等［25］在2020年已有报道。其研究针对耐多药结核患者探讨PZA 耐药基因突变特征，本研究与其不同。本研究尚存在不足：其一，进行分枝杆菌药敏检测结核患者中仅60%检测了PZA 的药敏性，本研究报道的本地区PZA 结核病流行状况可能与真实状况不同；其二，RSE 耐药菌株仅有8 株，其PZA 耐药率为50%是否能真实反映所有RSE 耐药结核患者的PZA 耐药率需要继续研究探讨；其三，纳入研究的结核患者缺乏明确的抗结核药物治疗信息，给全面深入的PZA 耐药影响因素的分析带来困难，后续的实验研究将予以深入探讨。本研究在表型耐药特征方面发现了利福平和异烟肼耐药可能是影响结核菌PZA 耐药的主要因素，而两者耐药是否在分子水平上对结核菌PZA 耐药产生影响需要进一步深入研究。