黄芪总皂苷通过调控LncRNA MIR22HG 和Caspase-3通路促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡

王馨，刘健，文建庭，忻凌，姜辉，万磊，孙玥，王桂珍，陈瑞莲

（安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031）

类风湿关节炎（rheumatiod arthritis，RA）是一种以滑膜对称性炎症和血管翳形成为特征的慢性全身性疾病，可导致关节软骨和骨的进行性破坏［1］。类风湿性关节炎的发病机制非常复杂，目前仍未完全阐 明。滑膜成纤维样细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA 的间充质干细胞，激活RAFLS 可导致大量细胞表面和可溶性介质的产生，这些介质有助于招募、保留和激活免疫细胞和常驻关节细胞，从而导致炎症和组织破坏［2］。细胞凋亡是调节体内组织成分动态平衡的关键机制［3］。凋亡不足的RA-FLS 和炎性因子相互作用推动了RA 的病理状态，促进RA-FLS 凋亡是RA 的新型治疗思路［4］。RA 患者体内常存在血管翳的形成，表现为凝血纤溶系统的异常［5］。

生物制剂在过去的10 年中己成为治疗RA 的主要突破点。在患者外周血以及滑膜局部高表达，体外实验显示TNF-α 中和后减少其他炎性因子的分泌，抑制RA-FLS 的增殖，促进其凋亡，因此将拮抗TNF-α 作为治疗RA 靶点。临床试验表明TNF-α治疗不但能够改善患者的症状和提高功能，而且可以有效控制病情的进展［6］。因此，本实验选取TNF-α 刺激的RA-FLS 作为对照模型组。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是新近发现的一类非蛋白编码RNAs［7］，其失调与多种疾病包括风湿免疫类疾病有关［8-10］。近期研究发现，MIR22HG 在肝癌中低表达，MIR22HG 过表达抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移［11］。本课题组前期选取了3 名RA 患者和3名健康对照者的PBMC 进行RNA 测序。使用生物信息学筛选了几种与细胞凋亡和自噬相关的差异表达lncRNA。发现与正常人相比，MIR22HG 在RA 中表达显著升高，差异具有统计学意义［12］。细胞凋亡是指在基因严格控制下，由促凋亡蛋白（Bax、Bak 及Bad 等）、抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL 及Bcl-w 等）和凋亡调控因子（Caspase 家族等）等共同参与下的细胞有序性死亡［13］。Caspase-3 是重要的细胞凋亡通路。Caspase-3 激活是细胞进入不可逆凋亡阶段的标志［14］。

黄芪总皂苷是中药黄芪的药效成分之一［15］，现代药理表明皂苷类有多种药理活性，包括免疫调节、多器官保护、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等［16］，在心脑血管系统、消化系统、免疫系统等疾病中多有报道。有研究发现，黄芪皂苷能增强可降低大鼠缺血／再灌注脑损伤模型中Caspase-3 基因的表达［17］，还能诱发心肌细胞凋亡［18］。但AST 对RA 的具体作用机制尚未进行研究。因此，本文旨在从凋亡和凝血两个方面对AST 调节MIR22HG／Caspase-3 信号通路影响RA 进行探索。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2021 年3 月至5 月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院RA 住院患者30 例，同期同一医院健康体检中心正常人30 例。用肝素钠抗凝管清晨空腹留取静脉血4 mL，利用Ficoll 提取人外周血单个核细胞（PBMCs），保存至-80 ℃冰箱备用。本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（编号：2019AH-12）。

纳入标准：符合2010 年美国风湿病学会（ACR）联合欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的诊断标准［19-20］；有完整的治疗前后实验室指标。排除标准：年龄在18 岁以下，75 岁以上者；合并有心、肝、肾等严重疾病以及严重关节外表现；孕妇或哺乳期女性；精神病患者；应用免疫抑制剂和生物制剂的患者。

1.2 分组及观察指标

选择30 例健康体检人群为正常组，选取30 例RA 住院患者为RA 组，比较正常组和RA 组PBMC细胞中MIR22HG 水平、凝血和凋亡指标。临床指标：LncRNA：MIR22HG；凝血指标：血小板活化因子（PAF）和前列腺素I2（PGI2）；凋亡指标：B 细胞淋巴瘤-2 相关X 蛋白（Bax）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase-8）。

1.3 药物与试剂

黄芪总皂苷（total astragalus saponins，AST；原料药，纯度99.99%）购自上海源叶生物公司，批号为J30N9T76378；人PBMC 分离液（天津灏洋生物公司），TRIzol 试剂（美国Life technogies 公司），反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司），实时定量PCR 试剂盒（上海塞默飞世尔科技公司，型号：PIKOREAL 96），胎牛血清（浙江天杭生物公司）；ELISA 试剂盒（武汉基因美生物科技公司）；反转录试剂盒（日本TaKaRa 公 司）；pcDNA3.1-NC 和 pcDNA3.1-MIR22HG（上海吉玛制药技术公司）。DMEM 培养基（上海吉玛制药技术公司）；Caspase-3、Caspase-8、Bax（小鼠抗人）和Bcl-2（小鼠抗人）（英国Abcam 公司）；DAPI（北京索莱宝科技公司）；Fluoromount-G 荧光封片剂（美国Sourthern Biotech公司）。

高速冷冻离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司（型号：JW-3021HR），PCR 扩增仪购自杭州晶格科学仪器有限公司（型号：K960）。高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR）；酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司，RT-6000）

1.4 细胞系培养

将RA-FLS 培养于含100 U／mL 浓度青霉素和0.1mg／mL 浓度链霉素的RPMI-1640 培养基中、于5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达70%时即可传代。将pcDNA3.1-MIR22HG 与阴性对照用Li-pofectamine2000 转染至RA-FLS 中，继续孵育24 h。

TNF-α 可诱导RA-FLS 发生持续炎症反应，本团队研究证实TNF-α 刺激RA-FLS 最佳浓度和时间分别为10 ng·mL-1和48 h。

1.5 RT-qPCR 检测MIR22HG、Bax mRNA 和Bcl-2 mRNA

用TRIzol 从转染细胞中提取总RNA。用TAKARA 试剂盒反转录1 μg 总RNA。具体反应条件为：95 ℃（30 s），然后分别以94 ℃（15 s）、45 ℃（45 s）和72 ℃（45 s）循环40 次。本研究中使用的引物如表1 所示。β-actin 被用作内参基因。用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。

表1 引物序列表

1.6 ELISA 检测PAF 和TXB2

收集各组RA-FLS 培养上清液，1 000 r／min 离心10 min，弃去沉淀。将上清液加入酶标板中（每孔100 uL），37℃孵育1.5 h，采用ELISA 方法，严格按照各试剂盒说明书进行操作，检测血清中PAF 和PGI2。

1.7 Western Blot 检测Caspase-3、Caspase-8、Bax 和Bcl-2

用RIPA 缓冲液纯化滑膜细胞中的Western Blot蛋白。SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液也用于蛋白质分离。用凝胶电泳法分离蛋白，以每孔5～10 uL 将蛋白加入SDS-PAGE 胶加样孔内。采用特异性单克隆抗体Caspase-3、Bax、Bcl-2 和Caspase-8。重复3 次。

1.8 统计学分析

（1）相关性分析 采用Spearman 相关性分析分析MIR22HG 与凋亡和凝血指标之间关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

（2）关联规则分析 采用SPSS Modeler 18.0 中的Aprior 模块分析MIR22HG 与实验室指标之间的关联性。“有”取值定为“T”，“无”取值定为“F”。指标改善定为“T”，指标未改善定为“F”。包括补充缺失数据，剔除错误数据。计算公式［22］如下：

2 结果

2.1 RA 患者MIR22HG、凝血和细胞凋亡指标的变化

与正常组相比，RA 患者MIR22HG、PAF、Bcl-2 mRNA 升高，PGI2、Bax mRNA 降低（P＜0.05）。见表2。

表2 RA 患者MIR22HG、凝血和凋亡指标的变化（）

表2 RA 患者MIR22HG、凝血和凋亡指标的变化（）

注：与NC 组比较，aP＜0.05

2.2 RA 患者MIR22HG 与凋亡指标和凝血指标的相关性及关联规则分析

相关性分析显示，PAF、Bcl-2 与MIR22HG 呈正相关，PGI2、Bax 与MIR22HG 呈负相关（P＜0.05）。见图1。

图1 RA 患者MIR22HG 与凋亡指标和凝血指标的相关性分析

设定后项为MIR22HG，前项为凋亡、凝血指标，最小支持度为20%，最小置信度为60%。经Aprior模块分析，MIR22HG 表达升高与Bax、PGI2 降低和PAF、Bcl-2 升高的支持度＞45%、置信度＞95%、提升度＞1。见表3。

表3 MIR22HG 与RA 患者凋亡凝血的关联规则分析

2.3 AST 抑制RA-FLS 活力

使用不同浓度（5%／10%／20%／50%）AST 分别作用于RA-FLS 12／24／48／72 h，选取细胞活力值接近0.5 时的AST 最佳作用浓度和时间为20%，48 h。见图2。

图2 不同浓度AST 处理12／24／48／72 h 后RA-FLS 的活力

2.4 AST 降低RA-FLS 中MIR22HG 的表达

与RA-FLS 组相比，经TNF-α 刺激后，RA-FLS的MIR22HG 的表达升高（P＜0.05）；AST 干预后，MIR22HG 的表达降低（P＜0.05）。见图3。

图3 黄芪总皂苷降低RA-FLS 中MIR22HG 的表达

2.5 AST 通过调控MIR22HG 对凋亡指标Bcl-2 mRNA 和Bax mRNA 的影响

与TNF-α＋RA-FLS 组相比，经AST 干预后，Bax mRNA 表达升高、MIR22HG 和Bcl-2mRNA 表达降低（P＜0.05）；与转染pcDNA3.1-NC 组相比，经转染pcDNA3.1-MIR22H 后，Bax mRNA 表达降低、MIR22HG 和Bcl-2mRNA 表达升高（P＜0.05）。见图4。

图4 RT-qPCR 法检测AST 通过调控MIR22HG 对RA-FLS 凋亡蛋白的影响

2.6 AST 通过调控MIR22HG 和凋亡通路Caspase-3 对凋亡指标Caspase-8、Bax 和Bcl-2 蛋白的影响

与TNF-α＋RA-FLS 组相比，经AST 干预后，Bcl-2蛋白表达降低，Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 8（caspase8）蛋白表达升高。与pcDNA3.1-NC 组相比，pcDNA3.1-MIR22HG 组Bcl-2 蛋白表达升高，Caspase-3、Caspase-8 和Bax 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图5。

图5 AST 通过调控MIR22HG 和凋亡通路Caspase-3 对凋亡指标Caspase-8、Bax 和Bcl-2 蛋白的影响

2.7 AST 通过调控MIR22HG 对RA-FLS 凋亡的影响

用NovoExpress 软件对流式细胞凋亡的图像进行分析，1 象限代表坏死细胞，2 象限代表晚期凋亡细胞，3 象限代表早期凋亡细胞，4 象限代表正常细胞。通过计算2＋3／1＋2＋3＋4 的细胞比例反映细胞的凋亡情况。流式细胞术结果显示，与TNF-α＋RAFLS 组相比，经AST 干预后细胞凋亡增多（P＜0.05），与pcDNA3.1 -NC 组相比，pcDNA3.1 -MIR22HG 组细胞凋亡降低（P＜0.05）。见图6。

图6 流式细胞术检测AST 通过调控MIR22HG 对RA-FLS 凋亡的影响

2.8 AST 通过调控Caspase-3 信号通路对RA-FLS凋亡蛋白的影响

与TNF-α ＋RA-FLS 组相比，经AST 或PETCM干预后，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax、Caspase-3 和Caspase-8 蛋白表达升高（均P＜0.05）。见图7。

图7 WB 法检测AST 通过调控Caspase-3 信号通路对RA-FLS 凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8 的影响

2.9 AST 通过调控MIR22HG 和Caspase-3 信号通路对凝血指标PAF 和PGI2 的影响

与TNF-α＋RA-FLS 组相比，经AST 干预后，PAF降低、PGI2 升高，与pcDNA3.1-NC 组相比，转染pc3.1-MIR22HG 后PAF 升高、PGI2 降低（P＜0.05）。见图8。

图8 ELISA 法检测AST 通过下调MIR22HG，上调Caspase-3 信号通路对RA-FLS 凝血因子PAF、PGI2 的影响

3 讨论

RA 是最常见的炎性关节炎，其特征是滑膜的凋亡不足、增生过度和血管翳的形成。滑膜细胞是滑膜关节的间质细胞，被认为在类风湿关节炎的发病机制中起关键作用［23］。AST 是黄芪家族的一员，已经证明它可以增加巨噬细胞的吞噬能力，增强机体免疫力［24］。通过选取临床30 例RA 患者和正常人的PBMC，检测MIR22HG 及凋亡凝血等指标，发现RA 患者体内RA 组MIR22HG 高表达，且存在凋亡和凝血指标的异常。Spearman 相关性分析结果显示，PAF、Bcl-2 与MIR22HG 呈正相关，PGI2、Bax与MIR22HG 呈负相关。关联规则结果显示，MIR22HG 表达升高与Bax、PGI2 降低和PAF、Bcl-2升高的支持度＞45%、置信度均＞95%、提升度均＞1。说明RA 患者体内存在凋亡不足和高凝状态，同时检测到异常表达的MIR22HG，但他们之间是否存在调控关系仍不可知，因为本研究旨在阐明AST 影响RA-FLS 的分子机制。

首先，用不同浓度AST 处理RA-FLS12、24、48、72 h 后观察其细胞活力，发现在20%AST 处理RAFLS 48 h 时细胞活力受到明显抑制，因此，选取此最佳处理浓度和时间进行下一步实验。为了阐明相关的分子机制，用RT-qPCR 方法观察发现经AST 处理后RA-FLS 中MIR22HG 明显降低，说明AST 可下调RA-FLS 中MIR22HG 的表达。Bax 和Bcl-2 是同属BcI-2 家族蛋白，是作用互为拮抗的2 种凋亡调控蛋白。正常情况下，Bax 和Bcl-2 以适当比例存在，参与细胞的基本生理过程，当细胞受到外界凋亡信号后，二者的含量或比例发生变化［25］。本文研究发现，经AST 处理后，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 蛋白表达升高。说明AST 可以增加促凋亡蛋白的表达，减少抑凋亡蛋白的表达，维持RA-FLS 的凋亡平衡。当Bax 表达增多时，形成的Bax／Bax 同二聚体明显增多，使线粒体膜通透性增加，细胞色素C 释放增多，激活Caspase 家族蛋白，特别是Caspase3 信号通路蛋白。WB 结果显示，经AST 处理后，Caspase3、Caspase8 等促凋亡蛋白升高。

MIR22HG 是一种和凋亡相关的基因，已在癌症中发现异常表达，可抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡［26］。WB 和RT-qRCR 显示，转染MIR22HG 过表达质粒，Bax 表达均降低、MIR22HG、Bcl-2 的表达均升高，流式细胞术结果显示，过表达MIR22HG 可挽救RA-FLS 的细胞凋亡能力，说明AST 是通过抑制MIR22HG 来发挥促凋亡作用的。

细胞膜表面的死亡受体受到胞外死亡信号刺激，促使线粒体释放细胞色素C 至胞浆，与Caspase9及凋亡酶激活因子1（Apaf-1）等形成即调亡小体，继而在 ATP 的作用下 Caspase9 酶切并激活Caspase3，使其由无活性的Procaspase3 酶原转化为有活性的cleaved-Caspase3，启动激酶级联反应，从而促进细胞凋亡［26］。因此Caspase-3 是关键的凋亡信号通路。使用AST 或Caspase 信号通路激动剂PETCM 作用于RA-FLS，与TNF-α＋RA-FLS 组相比，经AST 或PETCM 干预后，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax、Caspase-3 和Caspase-8 蛋白表达升高，说明AST 发挥与Caspase-3 通路激动剂类似的作用，可以促进RA-FLS 的凋亡。

综上所述，本研究发现，AST 可通过下调MIR22HG，激动Caspase-3 信号通路，促进凋亡，降低凝血因子的水平，从而发挥治疗RA 的作用，本文尚存在局限性和不足之处，比如全文对RA-FLS 细胞进行机制研究，缺少RA 患者的体内临床验证，未来将进一步完善对AST 疗效的体内验证。