牛奶蛋白过敏患儿维生素D代谢酶和其受体水平

李传应 吴 成

牛奶蛋白过敏(cow’s milk protein allergy, CMPA)是由牛奶蛋白引起的一种变态反应，多见于婴幼儿[1]。CMPA可影响全身多个系统，并以消化系统症状和皮肤症状为主要表现[1-2]。CMPA若没有得到及时、正确的诊断和治疗，可导致迁延性腹泻、呕吐、食欲低下，引起患儿生长发育障碍、缺铁性贫血、低蛋白血症等危害，严重影响患儿生活质量[1-3]。

维生素D是一种脂溶性维生素，可以促进皮肤细胞生长、分化及调节机体免疫功能[4]。维生素D代谢物25 羟维生素D [25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D]在CMPA患者体内水平显著降低[5]，前期研究[3]也发现维生素 D 联合游离氨基酸治疗CMPA 患儿效果优于单一游离氨基酸 。维生素D生物学效应主要是通过其受体(vitamin D receptor, VDR)发挥[4]。此外，维生素D在机体内活化以及代谢灭活过程受多种代谢酶的影响[6]。CMPA中25(OH)D水平低下和生物学功能异常是否与上述调控因素有关尚未明确。本研究旨在明确CMPA中VDR和维生素D代谢酶水平变化，研究其与CMPA病情程度联系为临床CMPA诊断和治疗提供潜在的生物学靶点，也为进一步揭示CMPA发病机理提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集安徽省儿童医院2018年5月至2020年5月诊治的32例CMPA患儿为研究对象(试验组)，其中男性13例，女性19 例；月龄2～5个月。根据其过敏症状轻重程度，将试验组患儿分为轻中度组(20例)和重度组(12例)。CMPA判断标准[7]：轻度具有以下一种症状，①呕吐、便秘、便血、腹泻等胃肠道反应；②慢性咳嗽、非感染性流涕及喘息等呼吸系统表现；③皮肤出现红斑、血管性水肿、湿疹样表现等；④持续肠痉挛≥3 h/d，≥3次/周，持续≥3周。中度具有上述胃肠道反应、呼吸系统、皮肤等多种表现。重度为上述表现加重，且出现严重过敏反应、呼吸困难、血压下降等。此外选取同期于本院进行健康体检的17例健康婴幼儿作为对照组，其中男性5例，女性12例，月龄2～6个月。

试验组和对照组对象性别构成、月龄、体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05) ，具有可比性。见表1。轻中度组和重度组患儿性别构成、幼儿月龄、喂养方式及体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05) ，具有可比性。见表2。试验组和对照组对象均进行常规性维生素D补充(伊可新，每粒含维生素D3 500 IU)，1次1粒，1天1次。两组婴幼儿均无黄疸，也未行光照疗法。试验组和对照组资料和样本获取均获得知情同意。本研究已获安徽省儿童医院医学伦理委员会批准(伦理批文号：EYLL-2019-029)。

表1 试验组和对照组对象一般资料对比

表2 轻中度组和重度组患儿一般资料对比

纳入标准：①患儿符合中华医学会2013版《中国婴幼儿牛奶蛋白过敏诊治循证建议》[7]CMPA 诊断标准；②患儿无先天性疾病；③患儿均为牛奶人工喂养的正常足月儿；④患儿亲属对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准: ①患儿在确诊CMPA前2周内有抗组胺使用史; ② 伴有细菌或者病毒感染者；③合并高钙血症、高磷血症、维生素D增多症等其他影响维生素D水平的疾病；④合并自身免疫缺陷性疾病的婴幼儿。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法检测25(OH)D水平 试验组和对照组对象在被纳入研究后清晨空腹收集肘静脉血2 mL置于EP管内，常温静置后，离心分离出血清，-80℃保存待测。酶联免疫吸附法(enzyme linked immumosorbent assay，ELISA)检测血清25(OH)D水平，ELISA试剂盒由上海将来实业股份有限公司提供。

1.2.2 聚合酶链式反应检测VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平 试验组和对照组对象在被纳入研究后，空腹收集肘静脉血2 mL，置于离心管中，密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM培养液，重悬细胞，细胞计数。采用Trizol试剂(TaKaRa大连宝生物)提取细胞中总RNA，后反转录为cDNA，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)对细胞中VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平进行检测。以三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因, 用2-ΔΔCT法分析相对表达量。

2 结果

2.1 试验组和对照组实验室指标比较 试验组血清25(OH)D水平低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05); 试验组CYP24A1 mRNA相对表达量试验组高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相对表达量两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 试验组和对照组25(OH)D及其受体、代谢酶指标比较

2.2 轻中度组和重度组患儿实验室指标比较 轻中度组血清25(OH)D水平低于重度组，差异具有统计学意义(P<0.05)；轻中度组CYP24A1 mRNA水平低于重度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相对表达量两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 轻中度组和重度组25(OH)D及其受体、代谢酶指标比较

2.3 相关性分析 CMPA患者血清25(OH)D水平与住院天数呈负相关(r=-0.470,P=0.007), CYP24A1 mRNA相对表达量与住院天数呈正相关(r=0.806,P<0.001)，25(OH)D水平与CYP24A1 mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.397,P=0.024)。见图1。

图1 CMPA患儿25(OH)D、CYP24A1mRNA、住院天数3者之间相关性分析

3 讨论

维生素D可调控细胞增殖、分化和改变其他细胞生物学活性，发挥免疫调节、改善糖代谢、调控肾素血管紧张素水平等多种生物学效应[4]。维生素D参与婴幼儿多种疾病病理过程[8]。研究[9-10]发现，过敏性哮喘儿童血清中的维生素D代谢物水平低于正常儿童，外源性补充维生素D能有效预防过敏性哮喘发生。也有研究[11]发现，患儿体内25(OH)D水平与过敏性症状持续时间具有密切的联系，其中25(OH)D水平越低，过敏症状持续时间越长。本研究发现，试验组患儿外周血25(OH)D水平低于对照组，轻中度组患儿的25(OH)D水平明显高于重度组患儿，提示维生素D活性代谢物可能参与CMPA病理进展过程。一般认为25(OH)D活性代谢物1,25(OH)2D通过与VDR结合发挥生物学效应[4]。因为VDR广泛表达于机体组织和细胞中[12]，为了进一步探讨CMPA中维生素D活性代谢物生物学功能异常是否与VDR水平变化具有一定的联系，本研究初步考察患儿外周血VDR水平变化。笔者发现，试验组患儿VDR基因表达水平与对照组相比无明显差异，且轻中度组患儿VDR基因表达水平与重度组患儿相比也无明显差异，提示25(OH)D可能是通过自身水平变化来参与和影响CMPA进程。

维生素D没有活性，在体内经2次羟基化生物代谢转化为活性代谢物发挥生物活性。维生素D运输到肝脏中经25-羟化酶CYP27A1作用, 可生成25(OH)D。随后，在CYP27B1 1-α 羟化酶催化下，25(OH)D转化为活性1,25(OH)2D。CYP24A1可催化1,25(OH)2D和25(OH)D生成无活性24位羟维生素D排除体外[6]。树突状细胞和淋巴细胞在内的多种免疫细胞均大量表达CYP27B1和CYP24A1[13-14]。25(OH)D是维生素D代谢物在体内最主要的存在形式，为进一步探讨CMPA中25(OH)D水平低下是否与维生素D代谢酶有关，并且初步考察25(OH)D相关代谢酶水平是否与CMPA疾病进程存在联系，本研究考察了维生素D体内活化和失活主要代谢酶CYP27B1、CYP24A1在PBMC中表达变化情况，研究结果表明试验组患儿外周血CYP24A1水平高于对照组，轻中度组患儿CYP24A1水平低于重度组患儿。然而本研究未发现CYP27B1在上述各组之间有差异，提示CMPA状态下异常高水平CYP24A1加速了25(OH)D代谢失活，抑制了维生素D活性代谢物对机体过敏反应的保护作用。早先研究[15]发现，免疫细胞CYP24A1受到炎症和免疫反应调控，在炎症因素刺激下，CYP24A1转录水平可显著增加，这与本研究结果相一致，即CMPA中免疫失调导致CYP24A1水平增高，加速25(OH)D生物代谢，从而抑制25(OH)D的抗炎和抗过敏作用的发挥。

综上所述，CMPA患儿外周血25(OH)D水平降低与CYP24A1水平升高有关。25(OH)D和CYP24A1水平与过敏症状严重程度存在一定的联系，提示CYP24A1可能是CMPA潜在的治疗靶点。