绿色木霉Tv-1511对黄瓜的促生增产作用及防病效果

霍雪雪,王庆玲,张豪,李哲,郑泽慧,李荣,黄艳华*,郭凯

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所,山东 济南 250014;2.南京农业大学资源与环境学院,江苏 南京 210095)

生物有机肥作为一种环保、高效的新型肥料,兼具复合微生物肥料及有机肥的优势。施用生物有机肥可以改善土壤的理化性质[1],并通过其所含特定功能微生物的生命活动促进植物对营养元素的吸收、利用,减轻病虫害,显著提高农作物产量和品质[2-3]。此外,生物有机肥主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为原料,不仅实现了农业废弃物的资源化利用,还可以有效解决环境污染问题,是对人、畜、环境安全无毒的环保型肥料[4]。生物有机肥发挥作用的核心是具有特定功能的微生物,因此微生物菌种的筛选是生物有机肥料应用中的关键。

木霉是一种重要的多功能丝状真菌,其产生的次级代谢产物种类丰富,生物活性多样,在工农业生产领域及环境保护领域都有广泛的应用[5]。常见木霉有绿色木霉(Trichodermaviride)、哈茨木霉(T.harzianum)、康氏木霉(T.koningii)、长枝木霉(T.longibrachiatum)等。其中绿色木霉是兼具促生和生防功能的有益真菌,是土壤环境中有毒物质的降解菌株,也是生物有机肥中重要的微生物菌种之一。研究发现,绿色木霉可以显著促进植物种子萌发、幼苗生长和产量增加[6-7]。在生物防治方面,绿色木霉主要通过竞争、重寄生和分泌次生代谢产物等方式,来抑制病原菌的生长[8-9]。此外,绿色木霉含有漆酶、水解酶、纤维素酶等,可用于环境污染物的生物降解[10]。

以木霉为功能微生物制成生物有机肥,具有促生、增产、防病等多重作用[2,11-12]。目前公开应用于生物有机肥生产的绿色木霉菌种类有限,进一步筛选出具有防病、促生和增产等多功能的绿色木霉具有重要意义。因此,本研究拟筛选获得一株具有良好的抑菌及促生效果的绿色木霉,并对其研制的生物有机肥的促生增产效果进行评估,以期为木霉类生物有机肥的推广应用和农业可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

筛选获得的木霉菌由齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所保存。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基和马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基。黄瓜品种‘津研四号’,由山东省农业科学院作物研究所选育。

示范试验在金星(日照)农业科技有限公司试验基地进行。土壤基本性质:有机质含量31.2 g·kg-1,全氮含量 2.6 g·kg-1,全磷含量 1.6 g·kg-1,全钾含量 14.4 g·kg-1,铵态氮含量16.8 mg·kg-1,硝态氮含量43.5 mg·kg-1,速效磷含量 36.9 mg·kg-1,速效钾含量64.3 mg·kg-1。供试有机肥由金星(日照)农业科技有限公司提供,以玉米秸秆和尾菜为原料,经过高温发酵生产有机肥,彻底腐熟后,含水量≤30%,有机质含量≥450 mg·g-1、全氮40 mg·g-1、全磷(P2O5)40 mg·g-1、全钾(K2O)20 mg·g-1、硫酸锌(ZnSO4)0.5 mg·g-1、游离氨基酸10 mg·g-1。供试木霉型生物有机肥由金星(日照)农业科技有限公司提供,按生物有机肥干重的5%添加木霉固体发酵物制成木霉生物有机肥,每克木霉孢子数量为2×108。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉的筛选与鉴定采集样品为烟草田土,地点为山东省潍坊市。去掉表层浮土,直至露出有植物根系的土层,采集土样;将土样碾碎制成土壤悬浊液,用无菌生理盐水进行梯度稀释;挑选单菌落转接到PDA平板上培养长出菌落,采用单孢分离法进行分离纯化,保存备用。利用显微镜观察该菌株的形态学特征;提取DNA,采用通用引物ITS1/ITS2进行PCR扩增、测序;在NCBI数据库中进行同源性比对,运用Mega 6.0软件以Neighbor-Joining法建立系统发育树,对该菌株亲缘关系进行分析。

木霉孢子液的制备与检测:将木霉接种到PDA固体培养基上,于28 ℃培养10 d,用无菌水冲洗分生孢子,收集孢子液,用血球计数板计数。称取10 g木霉发酵产物,加入无菌水和玻璃珠,于28 ℃振荡培养30 min,用4层灭菌纱布过滤,采用梯度稀释涂布平板计数方法进行计数,测定发酵物的含水量,得到每克干物质孢子量。

1.2.2 木霉对病原真菌的拮抗试验选用6种植物病原真菌,包括尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、层生镰刀菌(F.proliferatum)、白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。用打孔器在菌落边缘取直径为5 mm的菌块,在直径线上距两侧皿缘1.5 cm的对称位置分别接种植物病原真菌和绿色木霉Tv-1511,同时,以只接病原菌的平板作为对照。置于28 ℃恒温培养箱中培养,拍照记录真菌对峙情况。在对峙培养的PDA平板上,挑取Tv-1511与病原菌混合生长处的菌丝制成玻片,在光学显微镜下观察。计算抑菌率:

抑菌率=(对照病原菌菌落半径-处理病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径×100%。

1.2.3 黄瓜种子发芽试验挑选健康饱满的黄瓜种子先用75%(体积分数)乙醇消毒30 s,再用2%NaClO表面消毒3 min,无菌水冲洗4～5次,于超净工作台中风干至种子表面无水。选用直径为13 cm的培养皿,3层灭菌滤纸,每皿20粒种子,10 mL发芽溶液。以无菌水为发芽溶液的为对照组(CK),以加入木霉孢子液(浓度为103、104、105、106CFU·mL-1)为处理组(T),每个处理设置4个重复。统计种子的发芽率和侧根数,并测定胚根长、胚芽长等指标。

1.2.4 黄瓜促生试验挑选饱满一致的种子进行消毒处理,于25 ℃培养箱中遮光催芽至露白,然后于光照/黑暗(16 h/8 h)条件下培育一定时间后,挑选长势一致的幼苗移至水培装置进行处理。以1/2 Hoagland营养液为水培溶液的为对照组(CK),以加入木霉孢子液(浓度为104、105和106CFU·mL-1)为处理组(T),每个处理设置4个重复,分别在处理0、7和14 d时进行根长、株高、叶宽、叶长、鲜重、干重等指标的测定。

1.2.5 生物有机肥大田试验试验在金星(日照)农业科技有限公司试验基地进行。以不施肥(CK)和常规施肥(CF)为对照,以绿色木霉Tv-1511生物有机肥替代30%化肥为处理组(T)。试验随机区组设计,4个重复,小区面积100 m2,高畦栽培,株距25 cm。所有处理按当地的施肥方式所需养分统一施肥,常规管理。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 种子萌发指标每隔1 d观察1次种子发芽情况,并记录种子发芽数,以胚根长度达到其种粒长度的一半时作为种子发芽的标志,根据《农作物种子检验规程:GB/T 3543.4—1995》发芽试验的要求测定黄瓜种子发芽率。萌发第7 天,用直尺测定黄瓜的胚根长和胚芽长,并统计侧根数目。

1.3.2 黄瓜生长指标黄瓜促生试验中,分别在处理的0、7和14 d测量黄瓜幼苗的根长、株高、叶宽、叶长;多功能生物有机肥田间示范试验中,分别于幼苗期、初花期和结果期测量黄瓜株高、叶宽和叶长。其中株高是叶下端至生长点的高度,叶长是第1片真叶的长度,叶宽是第1片真叶的宽度。

1.3.3 黄瓜生物量黄瓜促生试验结束后,取单株先用自来水冲洗2次,再用蒸馏水冲洗1次,用吸水纸吸干后,将地上部分和地下部分分离,分别称其鲜重;将地上部分和地下部分分别放入培养皿中,105 ℃杀青15 min,65 ℃烘干至恒重,分别称其干重。

1.3.4 黄瓜产量多功能生物有机肥示范试验中,按商品瓜生产标准进行采收,第4次采收时,每小区随机采摘10个黄瓜,测定果实直径、果实长度和单果重。待采收结束后统计产量。

1.4 数据分析与处理

所有试验数据使用 Excel 2010软件进行统计,采用SPSS 20.0软件进行统计分析及显著性分析。结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学和分子生物学鉴定

筛选获得的菌株在PDA培养基上生长迅速,菌落初期呈白色绒状,致密,圆形;后期菌落开始产分生孢子,出现同心轮纹状的产孢区,颜色为绿色至深绿色(图1-A);菌丝透明,直立生出分生孢子梗,对称或互生分枝,形成二级和三级分枝,整体像树枝,分生孢子无色,多为球形(图1-B);构建系统进化树发现,该菌株与绿色木霉(Trichodermaviride)同属一个遗传分枝,亲缘关系最近(图1-C)。因此,筛选获得的菌株为绿色木霉菌,命名为Tv-1511,将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物管理中心,保藏编号为CGMCC No.16800。

图1 菌株的形态特征和系统进化分析Fig.1 Strain morphological characteristics and phylogenetic tree analysis A. 菌株的形态学特征 Strain morphological characteristics;B.菌丝与分生孢子显微形态 Microscopic morphology of hyphae and conidia;C.菌株的系统进化树分析 Phylogenetic tree analysis of strain.

2.2 绿色木霉Tv-1511在拮抗病原真菌中的应用

绿色木霉Tv-1511对6种植物病原菌具有明显的拮抗作用。接种2 d时,Tv-1511对各病原菌均表现出一定的抑菌效果,之后随着接种时间的延长抑菌效果逐渐增强直至相对稳定。接种8 d时,Tv-1511覆盖或侵入病原菌菌落,并形成大量的绿色分生孢子堆,对峙作用基本停止。在与尖孢镰刀菌、层生镰孢菌、串珠镰孢菌和灰葡萄孢菌的对峙平板上,Tv-1511菌落已占据3/4的平皿,侵入、覆盖或包围了病原菌菌落,抑菌率分别为68.50%、66.65%、68.96%和59.81%;在与白绢病菌和葡萄座腔菌的对峙平板上,Tv-1511占据大半个平皿,对病原菌形成明显的抑菌带或拮抗圈,病原菌落周围萎缩或出现菌丝消解痕迹,抑菌率分别为71.73%和59.87%(图2,表1)。在光学显微镜下观察到绿色木霉Tv-1511的菌丝可附着或缠绕于尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌和灰葡萄孢菌的菌丝上,致使病原菌菌丝发生变形、断裂和消解等现象,生长受到明显抑制。以上结果表明,绿色木霉Tv-1511可通过占领生态位、菌丝缠绕等重寄生作用和产生抑菌圈等方式来有效抑制病原菌的生长。

表1 Tv-1511对6种病原真菌的抑菌率Table 1 Inhibitory rate of Tv-1511 against six pathogenic fungi

2.3 绿色木霉Tv-1511对黄瓜种子萌发的影响

从图3可知:与对照相比,各浓度Tv-1511孢子液处理均能有效促进黄瓜种子的胚根长、胚芽长、侧根数和发芽率,且随着孢子液浓度的增加,促进作用呈先升高后下降的趋势,均在浓度为105CFU·mL-1达到峰值。与对照组相比,105CFU·mL-1处理组黄瓜的胚根长、胚芽长、侧根数和发芽率分别增加了35.70%、35.35%、57.5%和10.6%,且差异显著(P<0.05)。以上结果表明,绿色木霉Tv-1511可以促进黄瓜种子的萌发,且以孢子液浓度为105CFU·mL-1促进效果最显著。

图3 不同浓度Tv-1511孢子液对黄瓜种子发芽的影响Fig.3 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore on cucumber seed germination 柱上不同字母代表不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different letters on the column represent significant differences between different treatments(P<0.05). The same as follows.

2.4 绿色木霉Tv-1511对黄瓜幼苗生长的影响

从图4可知:与对照相比,不同浓度Tv-1511孢子液处理的黄瓜均呈现一定的生长优势,且以 105CFU·mL-1处理的生长优势最为明显。处理7 和14 d后根长、株高、叶宽、叶长差异显著(P<0.05),且变化趋势与种子萌发相关指标一致,均在105CFU·mL-1时达到峰值,其中处理7 d时的黄瓜根长、株高、叶长和叶宽分别是对照的1.28、1.34、1.16和1.16倍,处理14 d时相应的生长指标是对照的1.46、1.49、1.20和1.22倍(图5)。因此,绿色木霉Tv-1511可以促进黄瓜幼苗的生长,且以绿色木霉孢子浓度为 105CFU·mL-1时,对黄瓜幼苗生长的促生效果最显著。

图4 黄瓜在不同浓度Tv-1511孢子液处理下的表型分析Fig.4 Phenotypic analysis of cucumber under different concentrations of Tv-1511 spore liquid treatments

图5 不同浓度Tv-1511孢子液对黄瓜幼苗生长的影响Fig.5 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore liquid on cucumber seedling growthCK、104、105和106分别代表Tv-1511孢子液浓度为0、104、105和106CFU·mL-1。下同。CK,104,105 and 106 represent treatment with 0,104,105 and 106CFU·mL-1 Tv-1511 spore liquid,respectively. The same as follows.

分析不同浓度Tv-1511孢子液对黄瓜生物量的影响,结果(表2)表明,不同浓度Tv-1511孢子液处理的黄瓜地上部和地下部的鲜重和干重均显著高于对照(P<0.05),且变化趋势与幼苗生长指标一致,随 Tv-1511 孢子液浓度的增加呈先增加后降低的趋势,在浓度为105CFU·mL-1达到峰值。当Tv-1511为 105CFU·mL-1时,处理组的地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重分别为对照组的1.41、1.29、1.39和2.05倍。以上结果表明,绿色木霉Tv-1511可以促进黄瓜生物量的增加,且以孢子浓度为105CFU·mL-1时促进效果最显著。

表2 不同浓度Tv-1511孢子液对黄瓜生物量的影响Table 2 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore liquid on cucumber biomass g

2.5 绿色木霉Tv-1511制备的生物有机肥对黄瓜生长和产量的影响

2.5.1 对黄瓜生长的影响对不同生长时期(幼苗期、初花期、结果期)的株高、叶长和叶宽进行测定(图6)。与CK(不施肥)和CF(常规施肥)相比,T处理显著促进黄瓜的生长(P<0.05)。其中,T处理黄瓜幼苗期、初花期、结果期的株高分别是CK的1.37、1.43和1.42倍,是CF的1.06、1.17和1.22倍。叶长和叶宽的变化趋势与株高一致。与CK相比,结果期T处理黄瓜的叶长和叶宽分别增加了31.17%和47.31%;与CF相比,结果期T处理黄瓜的叶长和叶宽分别增加了18.04%和13.87%。因此,木霉Tv-1511生物有机肥替代30%化肥的施肥处理可以显著促进黄瓜的生长。

图6 不同施肥处理对黄瓜株高、叶长和叶宽的影响Fig.6 Effects of different fertilization treatments on plant height,leaf length and leaf width of cucumber CK. 不施肥 No fertilizer;CF. 常规施肥 Conventional fertilization;T. 绿色木霉 Tv-1511 生物有机肥替代30%化肥 Bio-organic fertilizer prepared from Trichoderma viride Tv-1511 instead of 30% of chemical fertilizer. 下同。The same as follows.

2.5.2 对黄瓜产量的影响从图7可知:T处理可以显著提高黄瓜的产量(P<0.05),其果实直径、果实长度、单果重和产量分别是CK的1.19、1.35、1.28和1.59倍,是CF的1.08、1.09、1.28和1.20倍。以上结果表明,由绿色木霉Tv-1511制成的多功能生物有机肥可以显著提高黄瓜的产量。

图7 不同施肥处理对黄瓜果实直径、果实长度和单果重及产量的影响Fig.7 Effects of different fertilization treatments on fruit diameter,fruit length, single fruit weight and yield of cucumber

3 讨论与结论

绿色木霉是一种广泛分布于自然界的生防真菌,对植物病原菌具有广谱的拮抗作用,其生防机制主要包括竞争作用[13]、重寄生作用[14]、抗生作用[9]和诱导抗性作用[15]等。在本研究中,我们发现绿色木霉Tv-1511菌株对环境具有较强的适应性,在与病原菌的对峙培养中,能够通过自身的快速生长和繁殖来竞争营养和空间,使病原菌菌落逐渐萎缩,说明Tv-1511可通过竞争作用来抑制病原菌的生长。在光学显微镜中观察到Tv-1511以缠绕、附着和侵入等方式寄生于病原菌菌丝上,使病原菌发生菌丝缢缩和断裂,说明它的拮抗机制包括重寄生作用。另外,在Tv-1511与白绢病菌和葡萄座腔菌的对峙培养中出现明显的抑菌带或拮抗圈,说明在与病原菌的对峙过程中产生了某种抗生性物质,有待进一步研究。

近年来研究发现,绿色木霉还是一种植物促生剂,可以显著提高种子萌发率,促进幼苗生长,增加作物产量[6-7]。其促生机制主要包括,分泌植物生长调节剂、抑制或降解根际有害物质、增加养分利用率、诱导植物抗性等[16]。但木霉对植物的促生作用具有一定的浓度依赖性,在一定浓度范围内,促生作用随着木霉浓度的增加而增强,当超过一定浓度后,促生效果会减弱,浓度过高时还有一定的抑制作用[6,17]。在本研究中,我们发现不同含量的绿色木霉Tv-1511孢子液对黄瓜的种子萌发、幼苗生长和生物量均有一定的促进作用,且促进效果随Tv-1511孢子液浓度的增加呈先增加后下降的趋势,在浓度为105CFU·mL-1时促进作用最显著。这主要与木霉产生的胶霉毒素、绿胶霉素、类植物生长素6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PP)等次生代谢产物有关。研究发现,胶霉毒素和绿胶霉素在高浓度下会抑制植物的种子萌发和幼苗生长,且不同植物品种对2种活性成分的忍受度不同[18]。木霉产生的类植物生长素6-PP在高浓度时抑制小麦的生长,但在低浓度时促进生长[19]。因此,木霉用作生防剂或促生剂时需要对菌株的种类和使用剂量进行限制。

木霉对植物的促生作用与植物生长基质有密切的关系。在缺少基质的情况下,木霉会受到土壤理化性质和有机质含量的影响,很难成功定殖并大量繁殖,严重影响其防病促生效果。因此,选择合适的基质尤为重要。杜婵娟等[20]研究发现,单独施用木霉菌肥对香蕉的促生作用和香蕉枯萎病的防治效果均不理想,而施用加入木霉孢子液的有机肥后对香蕉的促生防病作用显著提高。有机肥中的有机质既是肥力的基础,又是木霉的培养基质,木霉能够以有机肥为载体,快速生长繁殖,占据优势生态位,增加植物根际有益微生物的数量。研究发现,施用木霉生物有机肥可以显著促进辣椒[11]、芥菜[12]、黄瓜[21]等植物的生长。木霉生物有机肥除了单独施用外,还可以与化学肥料协同使用,在提高有机肥增产效果的同时,减少化肥的施用量,改善土壤及作物品质[22]。在本研究中,我们发现绿色木霉Tv-1511生物有机肥替代30%化肥处理可以显著促进黄瓜在不同生长时期(幼苗期、初花期、结果期)的生长,并显著增加果实直径、长度、单果重和产量。李瑞霞等[23]研究发现,减施25%的化肥同时配施贵州木霉NJAU4742制成的生物有机肥可以有效调控土壤养分和微生物区系,提高番茄的产量和品质。王欢[24]研究发现,减施30%的化肥同时配施木霉生物有机肥可以缓解土壤盐胁迫,增加土壤有机质和有效磷含量,促进黄瓜的生长和产量增加。因此,绿色木霉Tv-1511生物有机肥可以显著促进植物的生长和产量的增加,具有重要的推广应用价值。