达格列净对糖尿病肾脏病的保护作用及机制研究

何冲，姚新明，孔祥

(1.皖南医学院第一附属医院内分泌科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院研究生学院，安徽 芜湖 241001)

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常见的并发症，其病理特征主要包括肾小球系膜区细胞外基质沉积，肾小球系膜扩张，肾小球基底膜增厚，肾小球硬化及肾小管间质纤维化。DKD的临床特征表现为早期出现微量白蛋白尿，逐步进展至大量白蛋白尿和血清肌酐水平上升，最终发生肾功能衰竭[1]。DKD的发病机制尚未明确，有研究表明其与氧化应激和P38MAPK信号通路的激活有关[2-3]。葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂是一种新型的降糖药物，通过选择性抑制肾脏近曲小管SGLT2，减少对葡萄糖重吸收，促进尿糖排泄从而降低血糖[4]，在抗炎、抗氧化应激、降低尿蛋白排泄方面起到重要作用。达格列净是一种高度选择性的SGLT2抑制剂，可有效治疗2型糖尿病并预防DKD的发生发展[5]。本研究观察糖尿病大鼠肾脏病变与P38MAPK信号通路及氧化应激的关系，以及达格列净的调控作用，初步探究达格列净对DKD的保护作用及机制。

1 材料与仪器

1.1 动物 取SD大鼠28只，7周龄，雄性，SPF级，体质量(150±10) g，购自南京青龙山实验动物繁殖场，饲养于弋矶山医院中心实验室动物房，温度22～24℃，相对湿度50%～70%，12 h的明暗循环，自由进食标准食物和水。适应性喂养1周，测大鼠体质量(220±20) g时，开始实验。所有实验方案均经弋矶山医院动物伦理委员会批准。

1.2 药物 达格列净(批号MB3096)，购自阿斯利康制药有限公司，用超纯水配制成水溶液。链脲霉素(批号2196GR001)购自合肥志宏泰克生物技术有限公司。

1.3 试剂 PCR扩增试剂盒(货号：K0171)、逆转录试剂盒(货号：K1622)，购自于Thermo Fisher Scientific；PCR引物购自于北京六合华大基因科技有限公司；大鼠尿肌酐ELISA试剂盒(货号：FSEA3371)、大鼠尿蛋白 ELISA试剂盒(货号：FSEA3370)，购自于上海埃乐生物科技有限公司；SOD试剂盒(货号：A001-3)、MDA试剂盒(货号：A003-1)，购自于南京建成有限公司；P38MAPK蛋白抗体(产品编号：ET1702-65)、磷酸化P38MAPK蛋白抗体(产品编号：ER1903-01)，购自于华安生物；p22蛋白抗体(产品编号：sc-271968)、p67蛋白抗体(产品编号：sc-374510)，购自Santa Cruz Biotechnology；Nox2(pg91)蛋白抗体(产品编号：A1636)，购自ABclonal Ttechnology；Actin抗体(产品编号：BL005B)，购自biosharp；山羊抗兔IgG，(产品编号：BL003A)，购自biosharp；山羊抗鼠IgG，(产品编号：BA1050)，购自boster。

1.4 仪器 全自动组织脱水机 (ASP300S型，德国Leica公司)；半自动转轮切片机 (2245型，德国Leica公司)；正置荧光显微镜 (日本NIKON 80i公司)；垂直电泳仪、转膜仪 (美国Bio-rad公司)；凝胶成像系统 (Tanon-2500，上海)；高速低温离心机(Eppendorf 5810R)。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 大鼠适应性饲养1周后，当质量均为(220±20) g时，随机将大鼠等分为4组：①正常组(NC组)；②达格列净干预正常组(ND组)；③糖尿病组(DM组)；④达格列净干预糖尿病组(DD组)。禁食12 h后，DM、DD组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，按照体重给予链脲佐菌素60 mg/kg(新鲜STZ溶于0.1 m柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5)，腹腔注射。72 h后，通过血糖仪(One Touch Ultra，美国)测量大鼠空腹血糖(FBS)。若血糖>16.7 mmol/L，则造模成功。接着每天给ND组与DD组大鼠灌胃达格列净1 mg/kg，持续8周，每周测1次体重，每两周在上午9点测非空腹血糖水平。

2.2 样本采集 末次给药后将大鼠置代谢笼内，收集各组大鼠的24 h尿液，-20℃保存待测各组大鼠尿蛋白含量。采血后注射水合氯醛处死大鼠，分离肾脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重并计算肾脏指数，肾脏指数=双侧肾脏质量/大鼠质量×100%。称重后将右肾置于4%多聚甲醛固定用于检测肾脏组织病理形态，左肾置于-80℃保存。

2.3 实验方法

2.3.1 ELISA法测尿蛋白及尿肌酐 根据大鼠尿蛋白ELISA试剂盒说明书测定尿液中微量白蛋白含量。用酶标仪450 nm处测定样品的吸光度，进而计算出尿液中微量白蛋白含量(ng/ml)。根据大鼠尿肌酐ELISA试剂盒说明书测定尿液中尿肌酐含量。用酶标仪450 nm处测定样品的吸光度，进而计算出尿液中肌酐含量(ng/ml)。尿微量白蛋白含量除以尿肌酐含量，得出大鼠的尿白蛋白/肌酐。

2.3.2 WST-1法检测肾脏组织和尿液SOD活性、TBA法检测肾脏组织和尿液MDA含量 取大鼠左肾部分组织，制成10%匀浆，用BCA法测出各组蛋白浓度。根据大鼠SOD试剂盒说明书，测出各个标本在450 nm处的吸光度，进而计算出肾脏组织及尿液中SOD抑制率，从而计算出SOD活性。根据大鼠MDA试剂盒说明书，测出各个标本在532 nm处的吸光度，进而计算出肾脏组织及尿液中MDA含量。

2.3.3 Real-time PCR 检测p22 phox、p67 phox、Nox2(pg91)mRNA含量 取大鼠左肾部分组织，按照TRIZOL法提取大鼠肾脏组织总RNA，测出各个样品在260 nm及280 nm处的吸光度，通过比值计算出RNA纯度，同时记录下RNA浓度。再利用总RNA逆转录合成cDNA。PCR引物序列如下：

P22phox Forward:5′-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3′Reverse:5′-CACGACCTCATCTGTCAGTGG-3′(485 bp)P67phox Forward:5′-CGAGGGAACCAGCTGATAGA-3′;Reverse:5′-CTAAGGCACGCTGAGCTTCA-3′(740 bp)Nox2(pg91) Forward:5′-ATTCAAGATGGAGGTGGGACA-3′;Reverse:5′-AATGGAGGCAAAGGGCGT-3′(310 bp)GAPDH Forward:5′-ATGGTCTACATGTTCCAGTA-3′;Reverse:5′-TCAGATCCACAACGGATACA-3′ (590 bp)

以逆转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性5 min，接着95 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次。2-△△ct法计算p22phox、p67 phox、Nox2(pg91) mRNA相对表达量。

2.3.4 western blot检测p22 phox、p67 phox、Nox2(pg91)、P38MAPK、磷酸化P38MAPK蛋白含量 取左肾部分组织称重，置于离心管内，手术剪剪碎，按比例加入裂解液混匀(裂解液按1 ml RIRA加10 μl PMSF配置)，冰上研磨30 min，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，提取上清液。用BCA方法检测蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水煮，10 min，使蛋白变性。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳：制胶，上样，80 V恒压电泳30 min后，改为120 V恒压电泳60 min。 PVDF转膜：115 V恒压电泳75 min。10%脱脂牛奶室温封闭2 h。按说明书将一抗稀释至一定倍数，将封闭结束的PVDF膜用TBST洗净后至于稀释液后的一抗中，4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次10 min。加入稀释后的二抗，常温下孵育2 h。用TBST洗涤3次，每次10 min。超敏发光液显色，用全能型成像系统进行曝光，软件Image J计算各个条带的灰度值。将Actin或P38MAPK作为内参，p22phox/Actin、p67phox/Actin、Nox2(pg91)/Actin及p-p38MAPK/P38MAPK条带灰度值比分别代表p22 phox、p67 phox、Nox2(pg91)与p-p38MAPK蛋白相对表达量。

2.3.5 PAS染色观察大鼠肾脏病理形态 取大鼠右肾组织用多聚甲醛固定24 h，流水冲洗，去除组织中的多聚甲醛，进行脱水透明、石蜡包埋、切片，70 ℃加热1 h脱蜡。浸入高碘酸溶液10 min，蒸馏水冲洗5 min，加入Schiff染液反应15 min，蒸馏水冲洗10 min，苏木素复染1 min，蒸馏水冲洗10 min。1%盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗至返蓝，无水乙醇快速脱水，经二甲苯使切片透明，中性树胶封固。光学显微镜下观察肾脏组织病理形态。

3 结果

3.1 各组大鼠血糖及肾脏指数 与NC组比较，DM组大鼠血糖升高(P<0.01) ；与DM组相比，DD组大鼠的血糖明显下降 (P<0.01)。与NC组比较，DM组大鼠肾脏指数升高(P<0.01) ；与DM组相比，DD组大鼠的肾脏指数明显下降 (P<0.01)。见表1、表2。

表1 各组大鼠血糖的比较 单位：mmol/L

表2 各组大鼠肾脏质量/体重的比较

3.2 各组大鼠尿白蛋白/肌酐 与NC组比较，DM组大鼠尿白蛋白/肌酐升高(P<0.05) ；与DM组相比，DD组大鼠的尿白蛋白/肌酐明显下降 (P<0.05)。见图1。

注：与NC组，*P<0.05；与DM组，△P<0.05。

3.3 各组大鼠肾脏组织和尿液SOD活力及MDA含量 与NC组比较，DM组大鼠肾脏组织及尿液中SOD活力降低，MDA含量升高 (P<0.05) ；与DM组相比，DD组大鼠肾脏组织及尿液中SOD活力升高，MDA含量下降 (P<0.05)。见图2。

注：与NC组，*P<0.05；与DM组，△P<0.05。

3.4 各组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)mRNA表达 与NC组比较，DM组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)mRNA表达升高 (P<0.01) ；与DM组相比，DD组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)mRNA表达下降 (P<0.01)。见图3。

注：与NC组，*P<0.01；与DM组，△P<0.01。

3.5 各组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)、磷酸化P38MAPK蛋白表达 与NC组比较，DM组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)、磷酸化P38MAPK蛋白表达升高(P<0.05)；与DM组相比，DD组大鼠肾脏组织p22phox、p67phox、Nox2(pg91)、磷酸化P38MAPK蛋白表达下降 (P<0.05)。见图4。

3.6 各组大鼠肾脏组织病理形态比较 NC组：肾小球体积正常，系膜区未见玻璃样物质沉积，毛细血管基底膜未见明显增厚，肾小管上皮未见明显变性等异常；ND组：肾小球体积正常，系膜区未见玻璃样物质沉积，毛细血管基底膜未见明显增厚，肾小管上皮未见明显变性等异常；DM组：肾小球体积普遍增大，系膜区见玻璃样物质沉积，毛细血管基底膜部分区域增厚，部分肾小管上皮可见空泡样变性；DD组：肾小球体积尚正常，局部系膜区见玻璃样物质沉积，毛细血管基底膜局部区域增厚，个别肾小管上皮可见空泡样变性。见图5。

注：与NC组，*P<0.05；与DM组，△P<0.05。

注：病理图片放大200倍。

4 讨论

DKD是慢性肾功能衰竭的主要原因，其发病机制现在并不明确，涉及糖代谢异常、氧化应激、炎性反应等多种因素[6-7]。其中氧化应激在DKD发病过程中起重要作用[8]，而抑制氧化应激可改善DKD[9]。肾脏组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)磷酸氧化酶(NOX)家族是产生氧化应激主要来源。NOX由膜结合亚基(gp91phox 和 p22phox)和胞质亚基(p47phox、p40phox、p67phox和GTPase rac1或 rac2)组成[10]。NOX亚单位的过表达与活性氧产生有关，研究发现Nox2与跨膜亚基p22phox、p67phox是氧化还原反应中H2O2的来源[11]。越来越多的证据表明NOX诱导的氧化应激在DKD的发生和发展中起着关键作用[12]。本研究中糖尿病大鼠肾脏组织中p22phox、p67phox、Nox2(pg91) mRNA和蛋白的表达明显增高，同时肾脏及尿液中SOD活性明显降低，MDA含量则显著升高，表明氧化应激可能参与了DKD的发生发展。

SGLT2负责近端肾小管中段葡萄糖的重吸收，SGLT2 抑制剂可降低葡萄糖重吸收率和糖尿阈值，根据血浆葡萄糖浓度增加葡萄糖排泄[13]。同时研究表明SGLT2 抑制剂有明确的肾脏保护作用。SGLT2抑制剂抑制钠离子在近端小管重吸收，使得远端小管中尿液钠离子浓度升高，从而刺激致密斑，通过管球反馈(TGF)收缩入球动脉，降低肾小球内压，从而改善2型糖尿病肾脏超滤状态[14-15]。有研究显示达格列净可以降低24 h尿蛋白、白蛋白/肌酐比(UACR)、尿酸，保持GFR水平稳定[16-18]。Terami N等[19]的研究表明达格列净能改善DKD的特征性变化，减少小鼠的尿白蛋白、高血糖和β细胞损伤。本研究中服用达格列净治疗8周的糖尿病大鼠较未服用药物的糖尿病大鼠尿白蛋白、肾脏指数及肾脏组织病理形态明显改善，表明达格列净有保护肾脏的作用。

达格列净防治糖尿病肾脏病的机制尚不十分明确，可能涉及抑制氧化应激及P38MAPK信号通路。P38MAPK主要存在于细胞质内，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，正常生理状况下活性较低，可调控基因表达、抗氧化损伤等。P38MAPK结构上存在双磷酸化位点，可以被特异性 MAPK 激酶选择性激活，从而诱导 P38MAPK 磷酸化发挥生物活性[20-21]。P38MAPK信号通路可能参与DKD的发展。研究发现，在大鼠腹腔内注射白蛋白，2 d后足细胞损伤，足突消失，P38MAPK 磷酸化增强，P38MAPK信号通路的激活可能导致了肾脏足细胞损伤[22]。足细胞衍生的微粒(MP)也可通过P38MAPK 促进近端小管纤维化，介导 DKD 的发展[23]。高血糖环境下，ROS过量产生，会在肾脏组织细胞中诱导氧化应激并激活P38MAPK信号通路[24-25]。氧化应激诱导激活的P38MAPK 可以活化细胞凋亡因子Caspase-3 引起足细胞凋亡[26]。由此可见P38MAPK信号通路在糖尿病肾脏发病机制中起到重要作用。P38MAPK信号通路也可以介导氧化应激的产生，从而参与DKD的发展[27-28]。本研究中糖尿病大鼠肾脏组织氧化应激增强，P38MAPK信号通路被激活，达格列净治疗后，糖尿病大鼠血糖下降，肾脏组织氧化应激及P38MAPK信号通路被抑制。达格列净可能通过降低血糖，抑制P38MAPK信号通路及氧化应激，从而保护糖尿病肾脏。达格列净改善DKD的确切机制，需要进一步研究。