重金属复合污染对眼优角蚱代谢组的影响

容万韬, 宋 哲, 辛 磊, 邓维安, 覃玉月, 李晓东,*

(1.河池学院化学与生物工程学院, 广西河池 547000; 2.广西师范大学生命科学学院, 广西桂林 541000)

眼优角蚱Eucriotettixoculatus(Bolivar, 1898)隶属于直翅目(Orthoptera)蚱总科(Tetrigoidea)，广泛分布于中国南部各省及南亚地区(郑哲民, 2005; 邓维安等, 2007)，主要生活在溪流旁边生长有苔藓的湿润岩石周围，以苔藓及腐殖质为食物(肖舒晴等, 2019)。环境中的重金属主要通过眼优角蚱的取食行为进入体内，并对其肠道微生物产生影响(Lietal., 2021)，据此推测，重金属对眼优角蚱的代谢会有一定的影响。本研究选择金属矿区附近环境中生存的眼优角蚱为试验组，并以非金属矿区环境中的眼优角蚱为对照组，对其代谢组进行研究分析，以探明暴露于重金属复合污染下的眼优角蚱代谢组的变化情况，进而了解重金属复合污染对眼优角蚱代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 研究样地的选择和样品的准备

重金属复合污染样地选择在广西南丹县刁江流域一金属矿区(metal mining area, MA)附近，该矿区附近被镉(Cd)、锑(Sb)、砷(As)、锌(Zn)、铅(Pb)和铜(Cu)等多种重金属高度污染(钟雪梅等, 2016)；另一样地选择在广西融安县境内的一非金属矿区(non-metal mining area, NMA)。2020年8月分别在两个样地采集眼优角蚱成虫雌雄各45头，活体带回实验室。每个样地各取15头雄虫和15头雌虫组成一个样品，共2个样品(编号分别为：MA和NMA)，用来测定两个样地的眼优角蚱体内的重金属含量，以明确是否受到重金属复合污染影响。剩余的用于测定代谢组，每个样地取10头雄虫和10头雌虫，对其进行解剖，将肠道组织取出，用无菌双蒸水清洗干净，以此组成一个样品，金属矿区组和非金属矿区组均准备3个样品，即3个生物学重复(编号分别为：MA1, MA2和MA3以及NMA1, NMA2和NMA3)。样品置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 昆虫体内重金属含量的测定

采用微波消解和ICP-MS法对昆虫体内砷(As)、镉(Cd)、汞(Hg)、铅(Pb)、锌(Zn)、铜(Cu)、锡(Sn)、锑(Sb)和铬(Cr)共9种重金属含量进行测定，具体步骤为：(1)眼优角蚱成虫全虫烘干研磨：将准备好的样品烘干后放置研钵中充分研磨至尽可能细的粉末，干燥室温保存。(2)消解：称取0.2 g左右样品进行微波消解。(3)赶酸：消解完毕，放入通风橱中赶酸仪上赶酸40 min。(4)检测：待赶酸仪温度降至室温，取出样品，用超纯水定容至50 mL，混匀放置澄清后，再采用ICP-MS检测。同时称取国家标准品作分析空白，同标准参考。

1.3 样品代谢组分的提取

从-80℃冰箱中取出样品于冰上解冻(后续操作都在冰上进行)，用手术刀片切碎搅匀，用镊子夹取一部分到去皮后的EP管中，称量20 mg，放入一粒钢珠，在30 Hz的条件下匀浆30 s，反复4次，加入-20℃预冷的内标提取液，2 500 r/min振荡5 min，将样品在4℃ 12 000 r/min下离心10 min，吸取上清液400 μL到对应的EP管中，-20℃冰箱静置30 min，4℃ 12 000 r/min下再离心3 min，取上清200 μL装到对应进样瓶内衬管中，上机分析。

1.4 样品的代谢组分析条件

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)(ExionLC AD, https:∥sciex.com.cn/)和串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)(QTRAP®, https:∥sciex.com/)。

液相条件主要包括：(1)色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm；(2)流动相：A相为超纯水(0.1%的甲酸)，B相为乙腈(0.1%的甲酸)；(3)洗脱梯度：起始体积比为水/乙腈95∶5(v/v)，10.0 min内线性降低至水/乙腈10∶590(v/v)，并维持1 min，在11.0-11.1 min之间把体积比恢复为水/乙腈95∶55(v/v)并维持至14.0 min；(4)流速0.4 mL/min；柱温40℃；进样量2 μL。

质谱条件主要包括：电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)温度500℃，质谱电压5 500 V(正)，-4 500 V(负)，离子源气体Ⅰ(GS Ⅰ)55 psi，气体Ⅱ(GS Ⅱ)60 psi，气帘气(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation, CAD)参数设置为高。在三重四极杆(Qtrap)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)进行扫描检测(Chenetal., 2013)，利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据。

1.5 代谢组数据的处理与分析

基于嘉兴迈维代谢生物科技有限公司自建靶向标品数据库MWDB(metware database)，根据检测物质的保留时间(retention time, RT)、子母离子对信息及二级谱数据进行定性分析，利用三重四极杆质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)完成代谢物定量。由样本提取物混合制备成质控样本，对该样本进行重复上机得到mix01-03，以重复测试来监测分析样本在相同的处理方法下的重现性，用变异系数(coefficient of variation, CV)表示。CV值越低表示越稳定，质控标准是75%的物质CV值小于0.3。同时，在样本中加入内标参与整个提取和检测环节，通过计算内标的CV值表征整个项目提取检测环节的稳定性。利用R软件(www.r-project.org/)进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。基于正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)，初步筛选出不同样品间差异代谢物，结合单变量分析的P值或者差异倍数值(fold change)来进一步筛选出显著差异代谢物，筛选标准为fold change≥2和fold change≤0.5的代谢物，即代谢物在金属矿区组组和非金属矿区组组中差异为2倍以上或0.5以下为差异显著；同时在差异倍数值基础上VIP≥1的代谢物也为差异显著。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对代谢物进行功能注释以及代谢通路(pathway)富集分析。

2 结果

2.1 眼优角蚱成虫体内重金属含量

经过ICP-MS法测定两个样地眼优角蚱成虫体内重金属含量，由表1可知，金属矿区眼优角蚱(MA)体内重金属含量相比非金属矿区眼优角蚱(NMA)体内重金属含量，砷(As)是212.4倍，镉(Cd)9.3倍，汞(Hg)1倍，铅(Pb)18倍，锌(Zn)0.4倍，铜(Cu)1.4倍，锡(Sn)6.7倍，锑(Sb)61.0倍，铬(Cr)4.1倍，即除了汞(Hg)和锌(Zn)外，其余重金属含量均显示金属矿区眼优角蚱体内含量明显高于非金属矿区眼优角蚱体内的含量，说明在金属矿区生存的眼优角蚱体内重金属出现了累积。

表1 金属矿区和非金属矿区眼优角蚱成虫体内重金属含量Table 1 Contents of heavy metals in Eucriotettix oculatus adults in the metal mining area and the non-metal mining area

2.2 样本质控

质控样本(QC)由两组样品混合制备而成，用于监测分析样品在相同的处理方法下代谢物提取和检测的重复性，进而反映检测仪器的稳定性以及试验的可靠性。经样本质控分析， 正(A)负(B)离子检测模式下QC样本质谱检测总离子流图(total ion current, TIC) 重叠图显示代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性好，试验结果可靠，可进行下一步的研究分析。

2.3 主成分分析

为考察金属矿区组和非金属矿区组眼优角蚱体内代谢物是否存在差异，我们对分组样品进行主成分分析。6个样品的PCA分析，经过降维处理后横坐标(PC1)对组间样本差异贡献率为33.81%，纵坐标(PC2)对组间差异贡献率为24.5%(图1)。样品间距离越近则说明其体内代谢物越接近。组间样品的PCA分析显示，两组样品能够较好地分开。以上结果说明，金属矿区组眼优角蚱体内代谢物与非金属矿区组相比存在差异。

图1 金属矿区组和非金属矿区组眼优角蚱成虫体内代谢物主成分分析得分图Fig.1 Score of principal component analysis (PCA) ofmetabolites in Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group and the non-metal miningarea group百分比表示主成分对样品差异的贡献值；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示；MA1-MA3表示金属矿区采集的3个样品；NMA1-NMA3表示非金属矿区采集的3个样品。The percentage represents the contribution value of the principal component to the sample difference.Each point in the figure represents a sample， and the samples of the same group are represented by the same color.MA1-MA3 represent three samples collected from the metal mining area, and NMA1-NMA3 represent three samples collected from non-metal mining area.

2.4 重金属复合污染下眼优角蚱体内代谢物分类

基于UPLC-MS/MS检测平台，MA和NMA两组样品共检测到625种代谢物，占比较高的为氨基酸及其代谢物、脂肪酰类、有机酸及其衍生物、核苷酸及其代谢物、甘油磷脂类，分别为21.76%, 13.76%, 13.12%, 12.32%和10.24%。金属矿区组检测到622种代谢物，非金属矿区组检测到621种代谢物，有3种代谢物只存在于非金属矿区组的眼优角蚱体内，分别是牛磺胆酸、花生油酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺，有4种代谢物只存在于金属矿区组的眼优角蚱体内，分别是维生素D3、马尿酸、血栓素B2、黄素单核苷酸(FMN)；金属矿区组和非金属矿区组眼优角蚱体内的代谢物在组成类别上相似(图2)。

图2 金属矿区组和非金属矿区组眼优角蚱成虫肠道中代谢物的分类Fig.2 Classification of metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adults inthe metal mining area group and the non-metal mining area group

2.5 差异代谢物筛选

基于OPLS-DA，结合单变量分析的P值以及差异倍数值(fold change)对差异代谢物进行筛选。所有625种代谢物中，在同时满足fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的条件下，金属矿区组相比非金属矿区组共筛选到差异显著代谢物112种，其中上调59种，下调53种(表2和图3)。 在112种显著差异代谢物中，氨基酸及其代谢物(19.64%)、脂肪酰类(17.86%)、有机酸及其衍生物(12.50%)、核苷酸及其代谢物(9.82%)、苯及其衍生物(7.14%)总占比超过50%；上调的前10种显著差异代谢物分别为黄素单核苷酸(FMN)、马尿酸、维生素D3、血栓素B2、亚精胺、肉碱C12∶3、5-羟甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇和肉碱C10∶0异构体1；下调的前10种显著差异代谢物分别为N-乙酰-L-谷氨酰胺、牛磺胆酸、花生油酸、原胆酸、7-酮基石胆酸、12-酮基石胆酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脱氧-5-甲硫腺苷。说明金属矿区组眼优角蚱成虫体内代谢物含量与非金属矿区组间存在显著差异，显著差异代谢物主要集中在氨基酸类、脂肪酰类物质。

图3 金属矿区组比非金属矿区组眼优角蚱成虫肠道中显著差异代谢物火山图Fig.3 Volcano plot of significantly differential metabolitesin the intestine of Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group vs the non-metal mining area group图中的每一个点表示一种代谢物，Log2FC值绝对值大于1且VIP值大于1时，认为差异显著。红点代表上调的代谢物，绿点代表下调的代谢物，灰点代表检测到但差异不显著的代谢物。Each point in the figure represents a metabolite.When the absolute value of Log2FC is greater than 1 and the VIP value is greater than 1, the difference is considered significant.Red dots represent upregulated metabolites, green dots represent downregulated metabolites, and gray dots represent detected metabolites with insignificant difference.

2.6 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析

为探明112种显著差异代谢物与眼优角蚱机体功能的关系，利用 KEGG 数据库(Kanehisa and Goto, 2000)对显著差异代谢物进行功能注释和富集，共富集到132条通路(图4)，其中注释到生物体系统相关通路53条，新陈代谢相关通路45条，人类疾病相关通路共19条，遗传信息处理相关通路1条，环境信息处理相关通路11条，细胞过程通路3条。在注释到的132条通路中，共涉及49种差异代谢物，尚有63种差异代谢物未被注释到通路中。对富集程度排在前20的代谢通路的分析发现(图5)，富集最显著(P<0.05)的通路共4条，分别为甲状腺激素的合成通路、苯丙氨酸代谢通路、胆汁分泌通路、酪氨酸代谢通路，均与有机体系统和新陈代谢相关。经过KEGG功能注释及富集分析，112种显著差异代谢物中共有49种被注释到132条通路中，这些通路大多数与生物体系统和新陈代谢相关。

3 讨论

本研究对生活在金属矿区和非金属矿区的眼优角蚱的体内的重金属含量进行了测定，发现金属矿区眼优角蚱体内重金属砷、锑、铅、镉、锡、铬、铜的含量分别是非金属矿区眼优角蚱体内含量的212.4, 61, 18.0, 9.3, 6.7, 4.0和1.4倍，说明环境中的重金属可以累积到眼优角蚱体内。通过代谢组学研究，首次发现了眼优角蚱体内共有625种代谢物。对比金属矿区和非金属矿区眼优角蚱代谢物差异，发现112种代谢物因为重金属复合污染而产生了显著变化，其中超过50%(59种)代谢物上调(表2)，这说明重金属复合污染会导致眼优角蚱体内的代谢发生变化。类似现象在蜜蜂的研究上也有发现，Rothman等(2019)用镉和硒酸盐处理蜜蜂后，通过非靶向代谢组学方法获得391种代谢物图谱，并鉴定出58种代谢物，其中在镉处理下2种代谢物(类香豆酸和四糖)存在显著差异，在硒酸盐处理下7种代谢物存在显著差异。说明重金属污染对昆虫代谢具有一定的影响。

本研究中，在显著差异的代谢物中，黄素单核苷酸(FMN)、马尿酸、维生素D3、血栓素B2、亚精胺、肉碱C12∶3、5-羟甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇、肉碱C10显著上调(表2)。周良斌(2016)研究发现蓝光激发黄素单核苷酸产生的自由基可以抑制肝癌细胞生长。维生素D3参与机体钙磷代谢与骨质钙化，是调节骨代谢的重要内分泌激素之一，是一种新型的免疫调节剂，具有诱导细胞分化、抑制细

胞增生、拮抗胶元形成以及调节原癌基因表达、抑制肿瘤生长等功能(毛萌和刘震, 1991; 徐璐等, 2014; 赵宇和张晓良, 2015)。敖英等(2018)研究发现利用亚精胺处理细胞，能够增强细胞对DNA损伤的应答反应，并发现衰老的小鼠中内源性亚精胺含量降低，导致细胞对DNA损伤应答能力减弱，从而加快机体衰老进程。重金属通过昆虫的摄食活动进入肠道后，会导致肠细胞结构损伤，DNA断裂，细胞凋亡等(Osmanetal., 2015; 柳琳, 2017; Kheirallahetal., 2019)。据此推测，本研究中以上代谢物显著上调，可能与眼优角蚱抵御重金属对肠道细胞的损伤，维持细胞正常功能有关。在显著差异的代谢物中，前10种显著下调的代谢物有N-乙酰-L-谷氨酰胺、牛磺胆酸、花生油酸、原胆酸、7-酮基石胆酸、12-酮基石胆酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脱氧-5-甲硫腺苷(表2)，这些物质分属于胆汁酸类(牛磺胆酸、原胆酸、7-酮基石胆酸、12-酮基石胆酸)、氨基酸衍生物(N-乙酰-L-谷氨酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴)等。胆汁酸是胆固醇的代谢物，在机体胆固醇与能量代谢平衡和小肠营养物质吸收等方面起着重要作用(刘笑和王琰, 2019)，同时可以作为信号分子调节体内胆汁酸的代谢平衡、糖脂代谢与能量代谢平衡(李灏等, 2007; 刘笑和王琰, 2019)，也有研究发现胆汁酸有利于肠干细胞的激活，可以促进肠道再生(Sorrentinoetal., 2020)。在重金属复合污染环境中，眼优角蚱肠道内的胆汁酸类物质显著下调，由此推测，胆汁酸在对机体的能量调节中出现了消耗，也可能直接参与了代谢，以加强小肠营养物质的吸收，为机体提供更多的能量、激活肠干细胞分化成相关抗性细胞以为对抗重金属带来的损伤做准备有关，也可能是重金属导致体内合成胆汁酸的功能受阻，导致体内胆汁酸供应不足。因此，这些物质的显著下调可能与眼优角蚱机体的消化功能、蛋白质合成与分解、脂质代谢、增强机体对重金属的耐受性有关。

112种显著差异代谢物经过KEGG注释和功能富集，共有49种被注释到132条通路中，有40种被注释到代谢的通路中(图4)。富集显著的通路共有4条：甲状腺激素合成通路、催产素信号通路、胆汁分泌通路、酪氨酸代谢通路(图5)，这些通路共涉及14种差异显著代谢物。其中共有4种差异显著代谢物被注释到甲状腺激素合成通路。甲状腺激素是促进动物机体细胞生长、组织分化、发育和成熟的重要因素(徐建波等, 2014)，在一定剂量范围内能够加速蛋白质的合成和糖、脂的利用，从而提高机体代谢率(张坚等, 1992)。由此推测，甲状腺激素合成通路的富集，可能预示着眼优角蚱在重金属污染环境中，需要消耗更多的能量以提高对重金属的解毒和排泄作用(付伟利等, 2015)，从而更有利于机体对重金属损伤的修复。

图4 金属矿区组比非金属矿区组眼优角蚱成虫肠道中显著差异代谢物KEGG通路注释Fig.4 KEGG pathway annotation of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group

图5 金属矿区组比非金属矿区组眼优角蚱成虫肠道中显著差异代谢物的KEGG富集图Fig.5 KEGG enrichment of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group富集因子为差异表达的代谢物中在对应通路中的个数与该通路检测注释到的代谢物总数的比值，该值越大表示富集程度越大。P值为超几何检验P值，越接近于0，表示富集越显著。图中点的大小代表富集到相应通路上的差异显著代谢物个数。Rich factor is the ratio of the number of differentially expressed metabolites in the corresponding pathway to the total number of metabolites detected and annotated by the pathway.The higher the value is, the greater the enrichment degree is.P-value is the P-value of hypergeometric test.The closer to 0, the more significant the enrichment.The size of the dots in the graph represents the number of metabolites enriched in the corresponding pathways.

催产素可以借助抑制食物的摄入和胃排空，实现体重的控制、抗炎与氧化反应的应激改变，在精神疾病以及心血管病等多方面均具备明显作用，属于多重生物学作用特征的多肽激素(白红文和孙洪涛, 2020)，也有研究发现，中枢系统的催产素是一种食欲相关的神经元，参与小鼠采食过程中的调控过程(潘登等, 2016)。本研究中，催产素通路被显著富集到，推测重金属胁迫可能会促使眼优角蚱的食欲发生变化，而且更偏向于增加食欲，通过摄取更多的食物来获取更多的能量， 使机体保持足够的能量参与细胞的修复等，以应对重金属对机体的伤害。

胆汁的主要作用是将脂肪乳化成微滴以利于消化，还能促进脂肪酸及脂溶性维生素的吸收。胆汁酸是胆汁的重要组成成分，对水产动物的生长性能、消化酶活性、抗氧化功能、免疫功能及糖脂代谢等均有一定影响(孔祎頔等, 2020)。游离型胆汁酸主要包括胆酸(cholic acid, CA)和脱氧胆酸(deoxycholic acid, DCA)等。DCA能够刺激肝细胞分泌大量胆汁，消除胆道内胆汁的淤积，同时，药物、重金属等有毒物质随着胆汁外排出体外(Jinetal., 2019; 孔祎頔等, 2020)。本研究中显著差异代谢物中胆汁酸类物质显著下调，而与胆汁分泌相关的通路又被富集到，更说明了眼优角蚱可能利用了大量的胆汁酸参与机体代谢，从而促进重金属的排出。

酪氨酸代谢是氨基酸代谢的重要组成部分，可以由苯丙氨酸羟化生成，酪氨酸可以转化为儿茶酚胺，儿茶酚胺类物质作为类神经递质，与人类的健康和疾病联系紧密(Portaetal., 2020a, 200b; Taddeietal., 2020)。重金属胁迫可以对昆虫的神经系统造成影响(Ilijinetal., 2010)，因此该代谢物的变化可能与此有关。

本研究结果表明，生活在金属矿区的眼优角蚱体内有多种重金属累积，重金属可导致其肠道组织中的代谢物发生变化，这些变化的代谢物主要集中在氨基酸及其代谢物、脂肪酰类(肉碱)、有机酸及其衍生物、核苷酸及其代谢物等物质(图2)；显著差异代谢物富集到的通路主要集中在甲状腺激素的合成通路、催产素信号通路、胆汁分泌通路、酪氨酸代谢通路等，说明重金属复合污染会影响眼优角蚱的生长发育、细胞分化、能量代谢、细胞修复等。由于本研究的样品全部来自于野外，今后可结合室内重金属复合污染的试验来进一步探究重金属复合污染对眼优角蚱代谢组的影响，为揭示重金属对昆虫代谢影响提供基础资料。