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利用植物提取物绿色合成纳米银粒子及其对台湾乳白蚁的毒性

2022-05-19谢晓俊羊桂英于保庭莫建初

昆虫学报 2022年4期
关键词:纳米银工蚁白蚁

谢晓俊, 羊桂英, 于保庭, 胡 寅, 莫建初,*

(1.浙江大学昆虫科学研究所, 农业农村部农业昆虫学重点实验室, 浙江省作物病虫生物学重点实验室, 杭州 310058;2.全国白蚁防治中心, 杭州 310011)

近年来,随着害虫和病原微生物耐药性的增强,人们尝试将纳米技术与生物技术相结合,来发展兼具杀菌和抗虫活性的绿色纳米产品(Aziz and Akbarzadeh, 2017)。 纳米银粒子(silver nanoparticles, AgNPs)是指粒径达到纳米级别的金属银单质,因具有独特的化学稳定性、强导电性、高催化性、抗菌、抗病毒和抗蚊虫等特性,已经在农业、生物医学、环境科学、光化学工业和能源科学等领域都开展了广泛研究(Ahmedetal., 2016a; 彭红等, 2017; Prasadetal., 2017; Shietal., 2017)。AgNPs的制备是纳米技术研究的基础(Benelli, 2016)。传统的AgNPs主要通过物理和化学方法合成,存在高能耗、不稳定、步骤繁琐、使用的溶剂毒性强、污染严重以及对环境和非靶标生物有潜在危害等弊端(Adaketal., 2021)。利用植物提取液制备AgNPs是利用植物体内的生物活性分子进行深度组装,具有成本低廉、绿色无毒、可持续性好和环境安全等特点,是AgNPs合成的发展方向。

白蚁是危害房屋建筑和绿化树木的重要害虫,台湾乳白蚁Coptotermesformosanus是我国分布广泛、危害性较大的白蚁种类之一。利用安全、环保的药剂防治白蚁是落实乡村振兴政策和促进美丽中国建设的重要举措。研究发现,绿色合成的AgNPs对蚊虫具有良好的毒杀活性,但其对白蚁的毒杀效果目前仍不清楚。为了明确AgNPs对白蚁的防治效果,本实验以药用植物大黄Rheumpalmatum、白毛夏枯草Ajuganipponensis、苦参Sophoraflavescens和鱼腥草Houttuyniacordata的水提液为生物原料合成AgNPs,测定分析绿色合成AgNPs对台湾乳白蚁工蚁毒杀效果及其作用机理,以期为新型高效、绿色安全的纳米杀白蚁剂的研发提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料和仪器设备

1.1.1供试植物材料:大黄根茎、白毛夏枯草植株、苦参根和鱼腥草植株。

1.1.2供试白蚁:供试白蚁为台湾乳白蚁C.formosanus,由全国白蚁防治中心提供。试验前先将白蚁放在室内温度(27±1)℃、相对湿度80%±5%的环境下饲养1周以上,选取大小相近、行动活跃的乳白蚁成熟工蚁个体,称重并记录每10头工蚁的重量。

1.1.3仪器设备:恒温干燥箱、40目筛、恒温水浴锅、离心机、真空抽滤机、冷冻干燥机、手动匀浆器、Cary 60型紫外可见分光光度计(安捷伦)、NS-90纳米粒度分析仪(欧美克)、JEM-1400 Flash透射电子显微镜和Gemini SEM 300扫描电子显微镜等。

1.2 植物提取物的制备

将植物样品在80℃高温烘48 h后研磨过40目筛得到植物粉末。取10 g植物粉末加入到100 mL蒸馏水中,80℃水浴锅内加热2 h,每隔30 min振荡一次。室温下冷却后,以10 000 r/min转速离心获得上清液,经Whatman No.1滤纸过滤,得到澄清的植物提取液用于AgNPs的合成(Fouadetal., 2018)。

1.3 纳米银粒子的绿色合成

将10 mL植物提取液逐滴加入到90 mL 2 mmol/L硝酸银溶液中,在80℃恒温水浴锅内加热80 min,每隔20 min左右振荡一次,加热完毕取出,室温下冷却,然后以12 000 r/min的转速离心15 min,弃上清液,加入蒸馏水以10 000 r/min转速离心10 min,弃上清液。重复清洗3次,获得底部沉淀(Poopathietal., 2015)。将沉淀冷冻干燥分别得到大黄根茎AgNPs(H-NPs)、白毛夏枯草AgNPs(BX-NPs)、苦参根AgNPs(KS-NPs)和鱼腥草AgNPs(YX-NPs)粉末,将上述粉末保存在-80℃冰箱内用于表征和杀虫活性测定。

1.4 纳米银粒子的表征观测

1.4.1紫外可见光谱分析:取适量AgNPs粉末溶解于2 mL的蒸馏水中,混合均匀后用于测定。利用Cary 60紫外可见分光光度计(UV-Vis),分析波长200-800 nm范围内样品的吸光度,保存光谱中波长与吸光度的数据并利用Origin软件作图。

1.4.2扫描电子显微镜(SEM)分析:取干燥的AgNPs粉末,均匀涂抹至粘在载盘上的胶带上,将载盘放于镀膜机中喷镀金膜5 min,以提高样品的导电性,改善电子图像的质量。最后,样品上机抽真空,通过Gemini SEM 300扫描电子显微镜观察AgNPs的表面形态和聚集程度。

1.4.3透射电子显微镜(TEM)分析:取适量AgNPs粉末溶解于2 mL的无水乙醇中,超声波振荡分散5 min以充分混匀。然后将样品滴在覆盖有支持膜的铜网上,用吸墨纸去除多余的液体,接着将载网置于水银灯下5 min,待乙醇挥发完毕,充分干燥后,样品上机,通过JEM-1400 Flash透射电子显微镜表征AgNPs的结构和粒度。

1.4.4X射线能谱(EDS)分析:Gemini SEM 300扫描电子显微镜上配备能谱仪,进行元素分析以确保AgNPs的存在。

1.4.5纳米粒径分析:取适量AgNPs粉末溶解于2 mL的蒸馏水中,混合均匀后用于测定。利用NS-90粒径仪的动态光散射技术测量粒子大小,测定工作在25℃下进行,每个样品重复3次测量其流体力学粒度。

1.5 对白蚁的毒性测定

将AgNPs粉末溶解于蒸馏水中,配制成800, 400, 200, 100和50 mg/L 5个浓度梯度组,蒸馏水做空白对照组。取φ20 mm的滤纸片在蒸馏水及不同浓度的AgNPs溶液中浸渍10 s,取出晾干形成药膜,将其置于铺有2 g细沙(过40目筛后置烘箱80℃烘48 h)并加水湿润的培养皿(φ60 mm)中央。每个培养皿中移入50头健康且大小一致的台湾乳白蚁工蚁和2头兵蚁,每个浓度处理重复3次,将培养皿置于恒温恒湿培养箱内[温度(27±1)℃,相对湿度80%±5%]饲养观察,定期滴加适量蒸馏水湿润培养皿内细沙。每隔24 h记录工蚁死亡数,连续7 d,统计7 d后台湾乳白蚁工蚁的累计死亡率。

1.6 纳米银粒子的杀白蚁作用机制生化指标测定

1.6.1制备虫体匀浆:采用WHO规定的流程,经过适当修改,通过生化试验测定AgNPs处理7 d后白蚁体内的生化组分的变化(WHO, 1998)。取800 mg/L AgNPs处理的台湾乳白蚁工蚁(试验组)和蒸馏水处理的台湾乳白蚁工蚁(对照组)各30头,每次测定10头白蚁,每个处理3次重复。用蒸馏水洗涤白蚁体表,用纸巾吸去体表水分,将其收集到2 mL离心管中,冰浴匀浆后在4℃ 12 000 r/min转速下离心,取上清液用于虫体可溶性蛋白质含量、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)活性和滤纸酶活性(filter paper activity, FPA)测定。

1.6.2可溶性蛋白质含量测定:采用考马斯亮蓝法测定台湾乳白蚁工蚁体内可溶性蛋白质含量(刘玉明等, 2013)。分别取试验组和对照组的虫体匀浆液分别加入考马斯亮蓝G250试剂,混匀后,测定波长620 nm的吸光值并记录。

1.6.3AchE活性测定:AchE可催化乙酰胆碱水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸作用生成的5-巯基-硝基苯甲酸在412 nm处有最大吸收峰(林建国等, 2005)。因此,利用分光光度法测定412 nm处吸光度的增加速率即可计算出对照白蚁和处理白蚁虫体匀浆中的AchE活性。本研究采用苏州梦犀生物医药科技有限公司生产的AchE活性测定试剂盒测定样品3 min内吸光值的变化,计算第190秒和第10秒的吸光值差即为3 min内吸光值变化值。

1.6.4FPA测定:FPA水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物,在540 nm处有最大吸收峰,且反应液颜色深浅与还原糖的量成正比,利用这一原理可测定样品的纤维素酶总活性(或FPA)。本试验采用苏州梦犀生物医药科技有限公司生产的FPA试剂盒进行测定。

1.7 数据分析

根据对照组和AgNPs处理组工蚁的累计死亡率数据,利用SPSS软件的卡方检验进行统计学显著性分析,计算在95%置信区间的LC50和LC90。分别对各处理组的3个生化指标进行单因素方差分析和LSD法多重比较检验。

2 结果

2.1 纳米银粒子的表征

2.1.1紫外可见光谱分析:紫外-可见光谱分析是判断AgNPs合成的第一步。在本研究中,分别利用大黄根茎、白毛夏枯草全株、苦参根和鱼腥草全株的水提取液作为原料,与AgNO3发生还原反应80 min,混合液从最初澄清透明的淡黄色变成深棕褐色。4种AgNPs的紫外-可见光谱图显示分别在450, 435, 430和430 nm处出现最大吸收峰,证实了AgNPs的形成,在400~450 nm左右的表面等离子体共振峰(surface plasmon resonance, SPR)与AgNPs相对应(图1)。 这与之前报道的以植物为原料合成AgNPs的最大吸收峰在400~500 nm范围内的结果(Ahmedetal., 2016b; Rolimetal., 2019)一致。

图1 植物提取物合成的AgNPs紫外-可见吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet-visible spectra of AgNPs synthesized by plant extractsA: 用大黄根茎水提取物绿色合成的纳米银粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Rheum palmatum roots (H-NPs); B: 用白毛夏枯草全株水提取物绿色合成的纳米银粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Ajuga nipponensis plants (BX-NPs); C: 用苦参根水提取物绿色合成的纳米银粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Sophora flavescens roots (KS-NPs); D: 用鱼腥草全株水提取物绿色合成的纳米银粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Houttuynia cordata plants (YX-NPs).AgNPs: 纳米银粒子Silver nanoparticles.下同The same below.

2.1.2扫描电子显微镜分析:SEM分析的绿色合成AgNPs的结构和尺寸如图2所示,4种AgNPs多聚集,粒子呈球形。大黄根茎提取物合成的AgNPs (H-NPs)尺寸最大,粒径在80~180 nm之间,而白毛夏枯草全株提取物合成的AgNPs (BX-NPs)、苦参根提取物合成的AgNPs (KS-NPs)和鱼腥草全株提取物合成的AgNPs (YX-NPs)粒子偏小,粒径大小范围是50~100 nm。

图2 植物提取物合成的AgNPs扫描电子显微镜图Fig.2 Scanning electron microscopy (SEM) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.3透射电子显微镜分析:绿色合成AgNPs的典型TEM图像如图3所示。这些纳米粒子具有面心立方结构,分布相对均匀。大多呈均匀的球形,符合紫外可见光谱中SPR波段的形状。其中H-NPs的粒径明显大于其他三者的。粒径在80~180 nm之间,这与利用欧薄荷叶(MubarakAlietal., 2011)和欧洲小檗(Behravanetal., 2019)绿色合成的AgNPs大小相似。

图3 植物提取物合成的AgNPs透射电子显微镜图Fig.3 Transmission electron microscopy (TEM) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.4X射线能谱分析:如图4所示,AgNPs的EDS图谱均在3 keV处出现强特征峰,表明了Ag+还原成了Ag0。因为表面等离子体共振,对金属AgNPs的吸收非常理想。除了Ag的强峰以外,包括Cl在内的杂峰是因为各植物提取物中有其他元素,在合成过程中被AgNPs包裹而混杂其中。由于植物的各部分中含有多糖、脂质、生物碱、单宁、酚类、皂苷及萜类等化学成分。这些化学分子经过重组,在纳米银粒子合成中作为还原剂和稳定剂,将硝酸银溶液中的Ag+还原成纳米级别的银单质。根据目前研究发现:植物绿色合成的纳米银粒子样品为混合物,主要包含纳米银粒子(银单质)以及覆盖其表面的单宁、黄酮类和酚类化合物等成分。

图4 植物提取物合成的AgNPs的X射线能谱图Fig.4 X-ray energy dispersive spectrum (EDS) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.5纳米粒度分析:利用纳米粒度分析仪测量得到的4种AgNPs粒度分布如图5所示。与SEM和TEM分析的结果相一致,H-NPs粒径大多分布在100~200 nm之间,流体力学平均为179 nm;BX-NPs粒径在10~100 nm之间,平均为72 nm;KS-NPs和YX-NPs粒径分布相一致,粒径较小,平均约为69 nm。4种植物提取物合成的AgNPs粒子大小分布相对集中,说明粒子大小相对均匀。本研究通过SEM、TEM和粒度分析发现,4种药用植物提取物合成的AgNPs粒子大小均匀,粒径在69~180 nm之间,粒子多呈球形,说明本研究合成的AgNPs符合标准,可用于台湾乳白蚁的毒杀作用测定。

图5 植物提取物合成的AgNPs粒度分布图Fig.5 The particle size distribution maps of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.2 绿色合成纳米银粒子对台湾乳白蚁工蚁的毒杀活性

研究结果表明, 不同浓度AgNPs处理7 d内,随着AgNPs浓度升高,台湾乳白蚁工蚁的累积死亡率均逐渐升高,呈现出剂量依赖现象。SPSS数据分析结果显示AgNPs浓度与台湾乳白蚁工蚁死亡率之间呈线性相关关系,H-NPs, BX-NPs, KS-NPs和YX-NPs对台湾乳白蚁工蚁的LC50值分别为150, 340, 342和309 mg/L,LSD卡方检验达显著水平(P<0.05),说明数据的拟合优度良好(表1)。

研究结果显示,AgNPs处理7 d后,台湾乳白蚁成熟工蚁死亡率最低为88%(KS-NPs),最高为100%(H-NPs),而最低浓度50 mg/L处理下,各组白蚁的死亡率也近10%。并且4组AgNPs对工蚁的LC50值均较小,最小的H-NPs为150 mg/L,最大的KS-NPs仅为342 mg/L(表1),表明AgNPs在较低浓度处理下,较短的时间内就对台湾乳白蚁工蚁具有较好的毒杀活性。

表1 4种植物提取物合成的纳米银粒子处理7 d内对台湾乳白蚁成熟工蚁的毒性Table 1 Toxicity of AgNPs synthesized by four plant extracts to adult workers of Coptotermes formosanus in 7 d

2.3 绿色合成纳米银粒子毒杀台湾乳白蚁的作用机制

图6表明,800 mg/L 4种AgNPs处理7 d后,台湾乳白蚁工蚁体内的可溶性蛋白质含量以及AchE活性和FPA较对照均显著降低。其中,经H-NPs处理后的白蚁,其可溶性蛋白质含量从210 mg/L降低至120 mg/L,这说明AgNPs对台湾乳白蚁体内蛋白质的合成具有一定抑制作用。而AchE活性从313.16 nmol/min·g FW降低至46.25 nmol/min·g FW,表明AgNPs通过改变台湾乳白蚁体内AchE活性造成虫体神经中毒,引发功能失调死亡。FPA代表的是纤维素综合酶活性。AgNPs处理的台湾乳白蚁,其FPA显著低于对照,说明AgNPs处理后,台湾乳白蚁的纤维素综合酶活性均显著降低。鉴于台湾乳白蚁主要利用纤维素类物质作为其食物,体内的纤维素综合酶活性显著降低,会影响其食物消化和利用,这可能也是AgNPs导致台湾乳白蚁死亡的重要原因之一。

图6 800 mg/L AgNPs处理7 d对台湾乳白蚁成熟工蚁体内可溶性蛋白质含量(A)、乙酰胆碱酯酶活性(B)和滤纸酶活性(C)的影响Fig.6 Effect of 800 mg/L AgNPs on the soluble protein content (A), AchE activity (B) and filter paper activity (FPA) (C)in adult workers of Coptotermes formosanus at 7 d after treatment以蒸馏水饲喂组白蚁为对照组(CK)。图中数据为平均值±标准误; 柱上不同字母表示经LSD法多重比较检验差异显著(P<0.05)。Termites fed with distilled water were used as the control (CK).Data in the figure are mean±SE.Different letters above bars indicate significant difference by LSD test (P<0.05).

3 讨论

AgNPs广泛应用于伤口敷料、外用药膏、抗菌喷剂和抗菌织物等中(Slavinetal., 2017)。利用植物原料绿色合成AgNPs,具有高效、操作简便、成本低廉和绿色安全的特点,也是开发新型抗菌剂和杀虫剂的重要手段(Raietal., 2009; Benellietal., 2018)。AgNPs的大小和形状直接影响其作用,粒径小、均匀、呈球形的AgNPs在抗病毒、抗菌、抗氧化、生物催化以及对病媒控制方面都发挥着重要作用(Azizetal., 2019)。

本研究以4种药用植物为原料绿色合成AgNPs,通过UV-vis, SEM, TEM, EDS和纳米粒度分析等方式对合成的AgNPs进行验证,并表征了AgNPs的粒径大小、形状、聚集程度以及元素组成等特性,发现在室内条件下,较低浓度的AgNPs对台湾乳白蚁就具有较高的毒性,且AgNPs处理后白蚁体内的可溶性蛋白质含量、AchE活性和FPA均显著降低,说明AgNPs影响了台湾乳白蚁体内蛋白质的合成、正常的神经传导和消化利用纤维素的能力。因此,利用植物水提物绿色合成AgNPs有望为白蚁的综合治理提供新的手段。但是如若要实际应用,迫切需要在以下几个方面进行更深层次的研究:

(1)AgNPs和其他纳米颗粒在害虫的防治效果上的比较。基于最近研究,植物合成的纳米颗粒对包括蚊子、甲虫、蛾子、蜱螨虱等重要经济害虫显示出了一定的防治效果,其中绿色合成AgNPs的研究最为深入,关于其他纳米颗粒的害虫防治方面的相关文献甚少,且缺乏不同纳米颗粒对同一种害虫的毒性研究,无法进行数据对比。因此,后续应在绿色合成不同NPs的基础上,进一步检测它们对同一种害虫的毒性作用,从而针对性筛选出对目标害虫效果最显著、成本最低廉的绿色纳米颗粒。

(2)拓宽AgNPs毒性研究对象范围。学者利用细菌、真菌和植物制备的AgNPs,在较低浓度下对白纹伊蚊Aedesalbopictus、斯氏按蚊Anophelesstephensi、三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus和库态按蚊Anophelesculicifacies等的幼虫和蛹具有较高的毒性(Amerasanetal., 2016; Govindarajanetal., 2016; Kumaretal., 2018)。如今,AgNPs在蚊媒控制方面的潜力已被广泛认知, 然而有关农业和城市害虫的研究却屈指可数。相比于传统杀虫剂,绿色AgNPs毒性作用显著、使用剂量低且绿色环保,显示绿色合成的AgNPs具有广阔的应用前景。因此, 后续应加强其他媒介害虫、农业和城市害虫的毒性测定,拓宽研究范围。

(3)AgNPs对非靶标生物和生态环境的影响。AgNPs在体内的评估显示出高度生物相容性,对细胞活力、免疫功能等生长发育方面的负面影响较小。但是以上仅局限于实验室研究的初步结论,缺少在实际应用中的评估,所以在纳米农药释放到土壤中是否会对微生物和非靶标生物造成一定影响的研究上存在一定争议,但多数研究认为低剂量存在不会影响到生物的生长。另外,在水环境中的鱼类会生物累积水环境中的微量污染物,那么AgNPs的潜在释放可能通过食用鱼类危害人类健康,并且影响生态环境。但是目前对于AgNPs使用后与生态系统的相互作用关系还不清楚。因此,拓展AgNPs农药实际使用后的动态监测,将对评估AgNPs相关的环境风险等起到重要作用。

(4)AgNPs工业化生产面临的挑战。首先,植物源合成的AgNPs的粒径和形状决定其对害虫的防治效果,因此规范统一化的技术标准减少副产物生成、提高AgNPs产量将是工业化生产的第一大挑战。其次,粉末剂型的稳定性高于其他剂型,而实际使用时更倾向于液体配方。因此,提高固体AgNPs农药的持久性和稳定性将成为又一挑战。最后,进一步研究开发纳米农药的安全简便的应用技术、可获得性等也是一大难题。

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