基于网络药理学预测达原饮治疗新型冠状病毒肺炎作用机制及实验验证*

张雷，朱卫，黄豫，蒋洁君

昆山市中医医院，江苏 昆山 215300

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19，简称新冠肺炎)是一种急性呼吸道传染病，而中药在改善发热、咳嗽，避免或缓解炎症风暴，促进肺部炎症吸收、减轻并发症等方面独具疗效[1-2]，而Akt1则是治疗和预防COVID-19导致的肺组织损伤、消除病毒感染的潜在靶标[3]。因此，从药味组方角度阐明中药配伍规律的现代科学内涵，可以为充分发挥方剂药效提供思路[4]。

达原饮始载于《温疫论》，作为治疗“湿浊”的抗疫古方，有开达膜原，辟秽化浊，清热解毒之功，可使秽浊得化，热毒得清，阴津得复，为治疗新冠肺炎的代表性方剂[5]，能改善患者的临床症状和体征，缩短病程[6]。目前，网络药理学研究预测了达原饮治疗新冠肺炎的物质基础和机制特点，有效成分检测方法也得以建立[7-9]，但要进一步探究其深层次的方剂配伍内涵与确切作用机制，有必要结合网络药理学预测和实验验证方法[10]。

本研究建立药物、蛋白质和通路之间的联系网络，分析达原饮破结逐邪组(槟榔、厚朴、草果)、清热滋阴组(知母、白芍、黄芩)和甘草组(甘草)等不同组分的靶标和通路之间的关系。通过构建大鼠急性肺炎模型[11]，以脾脏中白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α含量以及PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表达水平为指标，探讨达原饮方剂配伍对药效的影响，进一步揭示达原饮治疗COVID-19引起的急性肺炎作用机制，阐释其科学配伍内涵[12]。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂达原饮由槟榔9 g，厚朴6 g，草果3 g，知母6 g，白芍6 g，黄芩6 g，甘草3 g组成，购自昆山市中医院，煎煮浓缩至含生药量浓度为1 g·mL-1，放凉，置于4 ℃冰箱备用。脂多糖(批号 L2880，sigma中国公司)；IL-2 、TNF-α ELISA试剂盒(批号20210302112、20210307245，上海信帆生物公司)；PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白抗体分别由Bioss、Gene Tex、CST中国公司提供。RIPA 裂解液(批号 P1010，北京索来宝公司)；RPMI-1640培养基(批号SH30809.01B，美国Hyclone公司)。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 目标化合物的选取以达原饮中7味药材的各结构类型代表性成分为主，结合Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中收录的7味药材的化学成分，共选取25个化合物为实验研究对象，其中包括槟榔中4个成分(槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱)；厚朴中3个成分(厚朴酚、和厚朴酚、β-桉叶醇)；草果中3个成分(1，8-桉油素、柠檬醛、香叶醇)；知母中4个成分(知母皂苷、芒果苷、异芒果苷、淫羊藿苷)；白芍中3个成分(芍药苷、白芍苷、没食子酸)；黄芩中3个成分(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)；甘草中5个成分(甘草苷、异甘草素、甘草酸、甘草酸二铵、甘草次酸)。

1.2.2 目标化合物作用靶点的预测通过Pubchem数据库获得化合物的3D结构后利用反向分子对接数据库 PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和Swisstargets数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测，将两个数据库中得分最高的前10个靶点筛选出来，导入STRING数据库(http：//string-db.org/)，得到蛋白互作网络(protein protein interaction,PPI)，以此分析各拆方组化合物的药理作用异同点。

1.2.3 作用通路的预测与网络构建将筛选后的靶点投入STRING数据库，得到所有靶点蛋白的官方命名，进行靶点通路富集；结合文献查阅等手段，将相关化合物、靶点和通路导入Cytoscape 3.6.0软件，利用Adobe Illustrator CS5绘制达原饮化合物-靶点-通路网络药理图，探究达原饮治疗急性肺炎的多靶点、多通路协同治疗特点，阐释其配伍合理性。

1.3 动物验证实验

1.3.1 动物模型构建与给药选用雄性SD大鼠36只，体质量(200±10) g，购自卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司，合格证号：SCXK(苏)2018-0002。将36只大鼠随机分为空白组、模型组、破结逐邪组、清热滋阴组、甘草组和全方组，每组6只。除空白组外，其余5组大鼠分别腹腔注射 5 mg·kg-1脂多糖(1 g·L-1)溶液建立急性肺炎模型，空白组和模型组按10 mL·kg-1灌胃生理盐水，其余4组分别灌胃给药达原饮提取液2 mL，连续3 d。所有大鼠造模前禁食12 h，自由饮水。

1.3.2 细胞悬液的培养于末次给药2 h后，将各组大鼠脱颈处死后浸泡在体积分数75%酒精中，超净台下，平衡达到室温，刻度吸管吸取大鼠淋巴细胞分离液，加入在培养皿中，将无菌尼龙网放置于培养皿上，无菌取出大鼠脾脏，放置于尼龙网上，研磨脾脏，使脾淋巴细胞经尼龙网过滤后浸入淋巴细胞分离液中。随后将培养皿内液体转移至离心管中，加入RPMI-1640培养液形成界面，离心后可见上层为RPMI-1640培养液，中层为絮状分布的淋巴细胞，下层为红细胞沉淀，吸取淋巴细胞，转移至另一个离心管中，并加入RPMI-1640培养液，吹打均匀，离心后可见白色沉淀即为淋巴细胞，弃上清液，加入RPMI-1640培养液吹匀重悬，细胞计数，调整细胞浓度。

1.3.3 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测IL-2、TNF-α含量取培养好的细胞悬液，放入CO2培养箱培养后，分别标记收集于离心管中，待胰蛋白酶消化细胞后收集沉淀，离心后收集上清液，-20 ℃保存备用。严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，于酶标仪上选择450 nm波长测定OD值，并根据试剂盒中提供的标准品浓度绘制标准曲线，计算IL-2和 TNF-α 质量浓度。

1.3.4 蛋白免疫印迹法(western blot，WB)检测PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达取培养好的细胞悬液并调整浓度，取适量加入RIPA裂解液，离心后取上清液，蛋白质定量后存于-80 ℃冰箱备用。BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取适量的蛋白质样品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，并使用半干式转移法转至NC膜上。转移后，膜用TBST冲洗3次，后经PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 一抗在4 ℃下孵育过夜。全蛋白以GAPDH为内参照。次日，用荧光标记的山羊抗兔HRP(11 000 Licor)室温避光孵育1 h，再TBST 冲洗3次，后加ECL显色剂入暗室进行曝光、扫描，以Image J 统计条带灰度值[13]。

2 结果

2.1 破结逐邪组作用特点通过筛选得到该组10个代表性化合物的49个作用靶点，其中草果有3个化合物，26个作用靶点；厚朴3个化合物，17个作用靶点；槟榔4个化合物，31个作用靶点。利用Cytoscape 3.6.0软件得到化合物-靶点作用关系图，通过STRING数据库分析靶点蛋白的PPI图，整合得到该组药理作用特点网络图，见图1。

图1 破结逐邪组作用特点网络图

通过功能分析，49个靶点蛋白主要与神经活动配体-受体相互作用、钙信号通路、胆碱能突触、PI3K-Akt信号通路、代谢途径和5-羟色胺能突触等过程相关。

2.2 清热滋阴组作用特点通过筛选，得到了该组10个化合物的44个作用靶点，其中，知母有4个化合物，18个作用靶点；黄芩有3个化合物，28个作用靶点；白芍有3个化合物，12个作用靶点。利用Cytoscape 3.6.0软件得到化合物-靶点作用关系图，通过STRING数据库分析了靶点蛋白的PPI 图，整合得到该组药理作用特点网络图，见图2。

图2 清热滋阴组作用特点网络图

通过功能分析，44个靶点蛋白主要与PI3K-Akt信号通路、Th17细胞分化、IL-17信号通路、MAPK信号通路、代谢途径和cGMP-PKG信号通路等过程相关。

2.3 甘草组作用特点通过筛选，得到了甘草中有5个化合物，32个作用靶点。利用Cytoscape 3.6.0 软件，得到化合物-靶点作用关系图，通过STRING数据库分析了靶点蛋白的PPI图，整合得到甘草组药理作用特点网络图，见图3。

图3 甘草组作用特点网络图

通过功能分析，32个靶点蛋白主要与代谢途径、内分泌抵抗、松弛素信号通路、HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路等生理过程相关。

2.4 达原饮配伍规律通过将达原饮的破结逐邪组、 清热滋阴组和甘草组所有代表性化合物的作用靶点、作用通路整合，获得147条有关作用特点的通路。将前30条通路(FDR<1×10-5)及其156个靶点，见表1、表2。利用Cystoscap 3.6.0软件得到化合物-靶点-通路的网络图，见图4。分析发现，破结逐邪组、清热滋阴组和甘草组既有共同的作用靶点群及通路群，又各有偏重，作用靶点涉及代谢途径、PI3K-Akt信号通路、胆碱能突触、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等各个环节，各通路群间通过共有靶点连接，显示出不同成分间的多靶点、多途径的协同作用[4]。针对实验目的，选择细胞因子 IL-2、TNF-α的表达以及PI3K-Akt通路进行验证。

表1 达原饮涉及的前30条通路信息

表2 达原饮涉及的156个靶点信息

注：蓝色菱形为活性成分，绿色椭圆为靶点，紫色箭头代表前30条通路

2.5 达原饮对大鼠脾淋巴细胞IL-2、TNF-α含量的影响与空白组比较，模型组大鼠IL-2、TNF-α含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功；与模型组比较，破结逐邪组、清热滋阴组、甘草组和全方组大鼠IL-2含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；破结逐邪组、清热滋阴组、甘草组IL-2、TNF-α水平与全方组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 达原饮对大鼠脾淋巴细胞IL-2、TNF-α含量的影响

2.6 达原饮对大鼠脾淋巴细胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达的影响与空白组比较，模型组大鼠PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，全方组、清热滋阴组和破结逐邪组大鼠p-PI3K、p-Akt 的表达均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，甘草组仅显著降低p-Akt含量，清热滋阴组显著降低PI3K蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。全方组PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达与各拆方组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4、图5。

表4 达原饮对大鼠脾淋巴细胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达的影响

注：1为空白组；2为模型组；3为破结逐邪组；4为清热滋阴组；5为甘草组：6为全方组

3 讨论

冠状病毒的实验研究和临床治疗助推了该病潜在机制的揭示，但为冠状病毒感染患者提供安全有效的药物方案仍在不断优化中。中医方剂达原饮是治疗疫病的公认有效药物，但其抗新冠病毒引起的急性肺炎的配伍内涵及潜在机制尚不清楚。本研究中，先通过拆方分析，构建了相关的药物-靶点-通路网络，预测了其交叉协同的作用特点，再通过细胞实验验证了可能的机制，从药效学角度揭示了达原饮治疗COVID-19引起的急性肺炎配伍科学内涵。

已有研究发现，冠状病毒感染在宿主细胞中通过激活PI3K-Akt通路或提高蛋白激酶磷酸化水平进而激活ERK-MAPK信号通路，进而完成病毒的复制和组装，通过激活细胞因子和化学趋化因子导致免疫过度应答而引发机体炎症和细胞因子风暴可能是主要致病机制[13]，在感染后可能通过降低自身活性以躲避宿主的免疫防御[14]。但中药可能通过降低炎性反应、调控PI3K-Akt通路干扰病毒入侵宿主及进行复制的过程，降低表达的同时进一步抑制病毒复制，从而发挥治疗呼吸道病毒感染的作用[15]。IL-2发挥双向调节作用，既促进T细胞的增殖与分化，又限制其反应以增强机体免疫耐受，TNF-α是细胞因子网络的启动因子，能诱导其他细胞因子如IL-6、IL-1β 等的释放，共同对组织造成损伤，又可以抑制病毒介导的细胞病变并降低病毒数量[16-17]；脾脏是免疫细胞居住、增殖并进行免疫应答和产生免疫效应物质的基地，内毒素(脂多糖)可以触发机体炎症反应与细胞损害，而脾切除后，脂多糖大鼠肺组织炎症反应和细胞损害明显加重[18]，间接证实脾脏在炎症调控过程中的重要作用。故通过分析脾淋巴细胞的免疫调节功能，可以对急性肺炎在内的相关肺损伤的临床治疗提供新思路。

网络药理学分析发现，达原饮中的25个化合物与156个(前30条通路)潜在的药物靶点相匹配，其药物可作用于PI3K-Akt信号通路的IL-2和MAPK信号通路的TNF等靶点发挥抗炎及免疫调节作用[16]。故本研究以炎症因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达水平为目标，以此探究达原饮配伍规律和作用机制是可行的。实验结果表明，模型组较空白组大鼠脾淋巴细胞中IL-2、TNF含量及PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著升高；治疗后，除清热滋阴组外，达原饮其余各组IL-2、TNF水平均明显降低；但在降低PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表达上，除全方组外，破结逐邪组、清热滋阴组、甘草组作用均不全面，不能有效降低Akt 表达，只能显著降低p-Akt表达，表明在LPS诱导急性肺炎后，抑制Akt的磷酸化确实是达原饮发挥作用的机制，从而证实了预测的结果。从作用效果角度看，在降低IL-2、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达上，破结逐邪组、清热滋阴组、甘草组效果均不及全方组(P<0.05)，这也说明达原饮中各药味通过协同配合，从炎症因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达方面起到治疗COVID-19的作用。

综上，本文运用网络药理学方法初步阐述了达原饮各组药材间协同配伍特点，并从PI3K-Akt信号通路关键基因及其磷酸化蛋白表达水平验证了预测的机制，揭示了达原饮治疗COVID-19引起的急性肺炎的科学内涵，并通过各项指标进一步展示了该药可能的作用靶标及途径。但这项研究有一定的局限性，只是针对网络药理学的一般性质，选取了部分靶点和通路进行了分析，需要更全面的研究[12]。