贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1脂肽物质对番茄采后软化及早疫病发生的影响

高振峰，赵 佳

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院/农产品贮藏保鲜研究所，太原 030031；2.山西农业大学 生命科学学院，山西太谷 030801)

番茄果实采后软化和病害发生既是影响番茄采后贮藏、运输和货架期的重要因素，也是番茄采后生物学领域研究的热点问题[1-3]。近年来为实现延缓番茄采后软化和降低病害发生的目的，研究者已从番茄采后软化机制、耐贮品种筛选、采后病害种类以及采后病害和软化控制措施等方面开展了大量研究，发现了FIS1[4]、SlGRAS4[5]、SlPP2C3[6]、NAC-NOR[7]、SlHSP17.7A, B[8]、LeACS2,S4[9]、Sl-ARF2a,2b[10]和YFT1[11]等与番茄采后后熟及软化相关基因；发现O-酰基化丝氨酸合成[12]、光-生长素-乙烯互作[10]、多聚半乳糖醛酸酶(PG) 和脂氧合酶(LOX)[1]、品种[13]和贮藏温度[14]等对番茄采后软化具有较大影响；发现匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、茄链格孢菌(Alternariasolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)等为番茄采后主要病原[15-16]；发现使用1-甲基环丙烯(1-MCP)[17]、二氧化氯(ClO2)[18]、硒[19]、腐植酸钙[20]和生物涂膜[21]等处理可延缓番茄采后软化；发现百里酚+水杨酸处理[22]、富氢水处理[23]、酵母甘露聚糖[24]和诺沃霉素A[25]等对番茄采后匍枝根霉(R.stolonifer)、茄链格孢菌(A.solani)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)和灰葡萄孢菌(B.cinerea)等病原真菌具有良好控制效果。虽然这些研究明确了番茄采后软化关键控制基因，明确了番茄采后病害种类，发现了一些番茄采后软化和病害控制措施，为番茄耐贮品种选育和采后贮藏保鲜技术开发奠定了基础，但品种选育的时间长、基于软化控制基因的改良品种少、物理措施的高成本与品质下降以及化学措施的安全性问题亦不可忽视[26-27]，因此绿色、安全的番茄采后软化和病害控制技术开发显得尤为重要。另外，虽然目前有关番茄采后的软化和病害防治的绿色生物技术开发也已有报道，但相关研究主要集中在植物提取物离体抑菌活性测定、抗性诱导物质筛选和抗病菌株筛选等方面，而有关生防细菌脂肽物质延缓番茄采后软化和模拟商业贮藏条件下早疫病害活体防效的研究还较为薄弱。

脂肽物质作为一类具有表面活性和主要由芽孢杆菌产生的小分子抗菌物质，目前不仅已有研究发现其对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、灰葡萄孢菌(B.cinerea)、美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)、指状青霉菌(Penicilliumdigitatum)、甘薯长喙壳菌(Ceratocystisfimbriata)、 匍枝根霉(R.strolonifer)和茄链格孢菌(A.solani)等多种病原真菌具有良好抑制效果[28-31]，而且该类物质还在医学、工业和食品等领域中具有较好的抗癌、抗肿瘤、降解原油和抑制食品传染病原等作用[32-34]。蒋梦曦等[35]研究发现伊枯草菌素A(Iturin A)与肉桂精油复配能够有效保持樱桃番茄品质，延缓硬度下降，延长贮藏时间，但有关该类物质及其与表面活性素混合物对其他番茄品种的采后软化延缓效果还未见相关报道。农业微生物资源开发与利用课题组前期从梓树中筛选出1株可产生脂肽类抗菌物质的贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1，该物质对茄链格孢菌(A.solani)的抑菌圈直经可达24.3 mm，且经LC-MS鉴定其主要为伊枯草菌素A(Iturin A)和表面活性素(Surfaction)[36]。因此基于上述研究背景，本研究通过贮藏试验重点对前期筛选出的对番茄早疫病菌(A.solani)具有良好抑菌活性的B.velezensisZSY-1不同质量浓度脂肽物质的番茄采后软化及早疫病控制效果进行研究；并在此基础上对不同质量浓度脂肽物质作用下的番茄采后软化相关酶活性进行测定，旨在明确脂肽物质的番茄采后软化及早疫病控制效果，以期为番茄采后保鲜提供一种新型生物保鲜剂开发源，并为番茄采后软化和早疫病生物控制技术开发提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试番茄与菌株 番茄果实(‘奇番一号’)于2019年6月14日采自太谷阳邑村(东经112°67″,北纬37°43″)番茄早疫病发病大棚。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZSY-1由农业微生物资源开发与利用课题组保藏和提供。

1.1.2 试剂与主要仪器 供试培养基及试剂，NA培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化钠5 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5；BPY培养液：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠 5 g，葡萄糖5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

主要试剂包括：无水甲醇(AR分析纯，天津市大茂化学试剂厂)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性检测试剂盒(Solarbio；货号:BC2660；可见分光光度法)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒(Solarbio；货号:BC2580；可见分光光度法)、纤维素酶(CL)活性检测试剂盒(Solarbio；货号:BC2540；可见分光光度法)和植物中脂氧合酶 (LOX)活性检测试剂盒(Solarbio；货号:BC0320；紫外分光光度法)。

主要仪器包括：超净工作台(SW-CJ-1FD，浙江苏净净化)、电热恒温培养箱(DH4000A，天津市通利信达仪器厂)、恒温振荡培养箱(DHZ-D，上海培因实验仪器有限公司)、冷冻干燥机(SCIENTZ-10N，宁波新芝生物科技股份有限公司)、高速冷冻离心机(Allegra X-30R，Beckman)、紫外可见分光光度计(SP-UV 2500，上海光谱仪器有限公司)、气相色谱仪(Trace GC，Thermo Fisher)、质构仪(ta-xt plus，英国/Stable Micro System)。

1.2 贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1脂肽物质制备

1.2.1 菌株ZSY-1活化及发酵培养 菌株ZSY-1活化:采用接种环挑取1环菌株ZSY-1 20%甘油-80℃保藏菌种于新鲜NA平板上划线，并于(26±0.5)℃恒温培养24 h。

菌株ZSY-1种子发酵液制备:采用接种环挑取1环活化后的菌株ZSY-1接种至装有100 mL BPY发酵液的250 mL三角瓶中，并于(28± 0.5)℃、160 r/min恒温振荡培养24 h后获得种子发酵液。

菌株ZSY-1发酵培养:按照φ=1%接种量，将菌株ZSY-1种子发酵液接种至装有800 mL BPY发酵液的1 000 mL三角瓶中，并于(28± 0.5)℃、160 r/min恒温振荡培养96 h后终止发酵。共接种3瓶。

1.2.2 脂肽物质制备 参照文献[36]从2.4 L BPY发酵液中提取脂肽物质，并经冷冻干燥后使用无菌水配制成质量浓度分别为20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL的脂肽物质溶液，用于后续试验。

1.3 番茄采前和采后脂肽物质处理

1.3.1 采前喷雾处理 于番茄采收前6 h每隔 2 h使用100 mL小喷壶喷雾不同浓度脂肽物质溶液，共喷雾3次，每处理处理6行，每次以果实表面不形成液滴滴落为宜。待最后一次喷雾处理果实表面干燥后进行采收，使用塑料周转箱运回实验室，剔除畸形果、机械损伤果，并挑选成熟度接近的红熟果于20℃进行贮藏试验。以无菌水为对照(CK)，每个处理10 kg果实，重复3次。

1.3.2 采后浸泡处理 采收未经采前处理的红熟番茄，同样使用塑料周转箱运回实验室，剔除畸形果、机械损伤果，并挑选成熟度接近的红熟果进行试验。每个处理10 kg果实，重复3次，并分别用不同浓度脂肽物质溶液浸泡处理1 h，室温风干后置于套有PE保鲜袋的塑料框中，于(20± 0.5)℃开展贮藏试验。以无菌水为对照(CK)，分别测定其0 d、3 d、6 d、9 d和12 d各项指标(病果率、果肉平均硬度、乙烯释放量及多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纤维素酶和脂氧合酶活性)。

1.4 番茄贮藏期早疫病发生统计

在番茄采后贮藏期间分别于贮藏3 d、6 d、 9 d和12 d时统计采前喷雾处理组和采后浸泡处理组中各处理的病果数，并计算病果率。

病果率(%)=(各处理病果数量/各处理果实总数)×100

1.5 番茄贮藏期果实硬度和乙烯释放量测定

使用质构仪(ta-xt plus)围绕番茄果实赤道部(避开腔室隔)等距离取4个点测定(探头直径 2 mm)果实硬度[13]，每处理测定5个果实。乙烯释放量参照李艳娇等[37]的方法采用气相色谱仪(Thermo Fisher，Trace GC)进行测定。

1.6 番茄贮藏期软化相关酶活性测定

从5个果实中取果肉30 g，采用购自索莱宝的试剂盒(规格见“1.1.2”)按照说明书分别对番茄果实的多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纤维素酶和脂氧合酶活性进行测定。

1.7 数据处理

采用Excel 2010对数据进行整理处理，Sigmaplot 10.0软件制作折线图，SPSS 17.0对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 采前喷雾处理对番茄采后早疫病控制效果

由图1可知，脂肽物质不同浓度间番茄采后早疫病害防治效果存在一定差异；随着贮藏时间的延长各处理病果率均呈现升高趋势，贮藏9 d后病果率增长最快；同一贮藏时期，脂肽质量浓度越高，病果率越低；贮藏至12 d，脂肽物质质量浓度为800 μg/mL和600 μg/mL时，番茄早疫病病果率明显低于其他处理，病果率分别为(15.27±4.43)%和(11.43±1.51)%；脂肽物质质量浓度≤100 μg/mL时，番茄采后病果率均达20%以上。另外，图1和图2显示，同其他处理相比虽然脂肽物质质量浓度为800 μg/mL和600 μg/mL时可较好控制番茄采后早疫病发生，但贮藏12 d时病果率高于10%同样造成较大损失，说明采前喷雾处理对番茄采后早疫病控制效果不佳。

图1 不同质量浓度贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1脂肽物质采前喷雾处理对番茄采后贮藏期早疫病控制效果的影响Fig.1 Control effect on tomato early blight during postharvest storage under pre-harvest spraying treatment with different mass concentrations of B.velezensis ZSY-1 lipopeptides

A～G依次为20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL，图4同

2.2 采后浸泡处理对番茄采后早疫病控制效果

由图3可知，随着贮藏时间的延长各处理病果率均呈现逐渐升高趋势，其中以脂肽物质质量浓度在200～800 μg/mL范围内病果率较低，均低于10%，且在贮藏前9 d无病果出现；脂肽物质质量浓度为100 μg/mL时，虽对番茄采后早疫病有一定控制效果，且贮藏3～12 d病果率均显著低于对照(图4)，但贮藏12 d后果实表面开始有浅褐色病斑出现，病果率达10%；脂肽物质质量浓度低于100 μg/mL时，处理组病果率虽低于对照，但病果率从贮藏至第9天开始便高于10%。说明浸泡处理脂肽物质质量浓度高于 200μg/mL方可使番茄在采后20 ℃有效贮藏12 d，早疫病病果率控制在10%以下。

图3 不同质量浓度贝莱斯芽孢杆菌 ZSY-1脂肽物质采后浸泡处理对番茄采后贮藏期早疫病控制效果的影响Fig.3 Control effect of tomato early blight during postharvest storage under postharvest soaking treatment with different mass concentrations ofB.velezensis ZSY-1 lipopeptides

图4 不同质量浓度贝莱斯芽孢杆菌 ZSY-1脂肽物质采后浸泡处理对番茄采后贮藏12 d早疫病控制效果的影响Fig.4 Control effect of tomato early blight after storage 12 d under postharvest soaking treatment with different

2.3 贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1脂肽物质对番茄采后硬度变化的影响

由图5-A可知，不同质量浓度脂肽物质采前喷雾处理后的番茄贮藏期果肉平均硬度同对照相比差异不显著，说明采前喷雾处理对番茄采后软化无明显作用。图5-B显示，一定质量浓度脂肽物质采后浸泡处理对延缓番茄采后贮藏期软化具有明显作用，其中以脂肽物质质量浓度为200 μg/mL和400 μg/mL时延缓效果较好，贮藏 12 d时番茄果肉平均硬度分别为对照的1.48倍和1.55倍；脂肽物质质量浓度为800 μg/mL和600 μg/mL时，浸泡处理对番茄采后软化则无明显延缓作用，贮藏12 d后的番茄果肉平均硬度同对照相比差异不显著，说明浸泡处理方式下高质量浓度和低质量浓度的脂肽物质均对番茄采后软化无明显延缓作用。

A.采前喷雾处理；B.采后浸泡处理

2.4 采后浸泡处理对番茄采后软化相关酶活性的影响

由图6可知，不同处理下的番茄果实多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和脂氧合酶活性均随着贮藏时间的延长而呈现逐渐升高趋势；纤维素酶活性在整个贮藏期均高于初始值，呈现先升高后下降再升高趋势；脂肽物质质量浓度为200 μg/mL和400 μg/mL时，虽然2处理对4种酶活性影响差异不显著，但2处理组下的4种酶活性明显低于对照和其他处理组，说明脂肽物质质量浓度在 200～400 μg/mL范围内对延缓4种酶活性升高具有一定作用，同时进一步说明4种酶活性同番茄采后软化密切相关。

A.多聚半乳糖醛酸酶；B.β-半乳糖苷酶；C.纤维素酶；D.脂氧合酶

2.5 采后浸泡处理对番茄贮藏期乙烯释放量的影响

由图7可知，各处理均在贮藏3～6 d期间乙烯释放量迅速上升，斜率明显高于其他时间段。整个贮藏期，脂肽物质质量浓度除400 μg/mL和200 μg/mL外，其余各处理乙烯释放量呈现先升高后下降趋势，并于贮藏9 d时达峰值；贮藏0～ 9 d期间，脂肽质量浓度为400 μg/mL和200 μg/mL时番茄乙烯释放量低于其他处理，贮藏至 12 d时乙烯释放量与其他处理差异不显著，但高于第9天，说明脂肽质量浓度为200～400 μg/mL时可有效降低番茄贮藏期间的乙烯释放量，推迟乙烯释放高峰，对延长其贮藏期具有较好作用。

图7 不同质量浓度贝莱斯芽孢杆菌 ZSY-1脂肽物质对贮藏期番茄乙烯释放量的影响Fig.7 Ethylene release of tomato during storage with different mass concentrations of B.velezensis ZSY-1 lipopeptides

3 讨论与结论

番茄早疫病作为番茄采后常见的真菌病害之一，其病原孢子在低温下亦可萌发导致病害发生，对番茄采后贮藏、货架供应及食品安全具有重要影响[16,38-39]。虽然目前为有效防治该采后病害发生，研究者从采收时期(绿熟到初熟)、采前化学防治、拮抗微生物筛选和诱导抗性等角度进行了大量探究[40]，然而绿熟到初熟期采收导致番茄风味降低与不易软化、化学防治的病原菌抗药性与药剂残留、拮抗微生物低温下活性下降以及诱导抗性技术的生产实践应用研究薄弱等问题亦不可忽视，因此模拟商业贮藏模式下的生物防治技术研究显得尤为重要。此外，还有研究发现iturin A与肉桂精油复配不仅对番茄采后软腐病菌(Rhizopusstolonifer)具有良好抑制作用，而且可有效降低樱桃番茄贮藏期腐烂率和延缓软化[35]，说明脂肽物质在病害防治和保持樱桃番茄品质方面均具有积极作用。然而，有关脂肽物质对模拟贮藏条件下的番茄采后早疫病发生和采后软化的控制效果还不清楚，因此本研究从生产实际出发，模拟番茄商业贮藏条件，对菌株ZSY-1脂肽物质的番茄果实采后早疫病发生的控制和软化延缓效果进行测定，旨在为番茄果实采后生物贮藏保鲜技术和产品开发奠定理论基础。

本研究以目前常用的2种处理方式(采前喷雾和采后浸泡处理)模拟商业贮藏模式考察了菌株ZSY-1不同质量浓度脂肽物质对红熟番茄果实采后早疫病发生的控制和软化延缓效果，结果表明：2种处理方式中以浸泡处理效果较优；浸泡处理方式下高质量浓度的脂肽物质(800 μg/mL和600 μg/mL)虽然对番茄采后早疫病害发生具有较好控制效果，但加速了番茄采后软化，推测这种现象可能与脂肽物质的强表面活性作用有关；脂肽物质在质量浓度为200 μg/mL和400 μg/mL时不仅可有效控制番茄采后早疫病病发生，而且可有效延缓番茄采后软化，研究结果与蒋梦曦等[35]相同，进一步证明脂肽物质在延缓番茄果实采后软化方面具有积极作用。另外，在番茄采后早疫病控制方面，菌株ZSY-1脂肽物质同赤霉素与芸苔素内酯[41]、酵母甘露聚糖[24]、壳聚糖[42]、植物精油[43]以及解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)004抗菌物质与异菌脲[40]等具有相似效果，说明菌株ZSY-1脂肽物质是一种控制番茄采后早疫病发生和延缓软化的优良生物保鲜剂候选开发源。

随后为进一步验证脂肽物质对番茄果实采后软化延缓效果，本研究还对目前已证实的与番茄采后软化密切相关的酶活性和乙烯释放量进行了测定，结果表明：脂肽质量浓度200 μg/mL和400 μg/mL可有效延缓番茄采后软化且贮藏第3天起，不仅2个处理下的多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纤维素酶、脂氧合酶活性和乙烯释放量均显著低于对照组，而且乙烯释放量在整个贮藏期均呈现上升趋势，未出现下降。研究结果与叶面喷施维生素A和钙混剂[44]、一氧化氮(NO)[37]及乙醇新型固体缓释剂[45]等处理具有明显相似性。王文雅等[46]研究发现贮藏期Ca2+处理番茄乙烯释放量呈现先升高后下降再升高趋势；LOX酶活性呈现先下降后升高再下降又升高趋势；生吉萍等[1]发现贮藏期番茄果实PG和LOX酶活性呈现先升高后趋于稳定；陈少阳[47]用1-MCP与紫外以及柠檬醛组合处理番茄果实，发现纤维素酶活性在贮藏期前3d急剧下降，随后变化趋势则相对平缓；王沙沙[48]用H2S和D/L-CD处理后发现番茄纤维素酶活性在贮藏至第3天时最高；多聚半乳糖醛酸酶活性呈波动下降趋势；硬度呈现逐渐下降趋势，与本研究有差异，这可能与处理方式、采收时期、贮藏条件、番茄品种以及处理药剂不同有关。

综上，虽然本研究发现菌株ZSY-1脂肽物质质量浓度为200 μg/mL和400 μg/mL时可有效延缓番茄采后硬度下降和控制番茄采后早疫病发生，降低番茄软化相关酶活性，推迟乙烯释放高峰与降低乙烯释放量，但在后期还需进一步扩大试验规模(加大贮藏试验量和增加试验品种)，并通过实时荧光定量PCR(qPCR)验证相关基因表达量来进一步确定菌株ZSY-1脂肽物质延缓软化的效果，旨在明确脂肽物质在番茄采后贮藏保鲜中的应用潜力，为新型生物保鲜产品和技术开发提供参考。