阿泰灵对苹果锈果类病毒病田间防效及机制研究

党海月，张妮妮，朱明旗，王 妍，逯 茜，王思敏 ，梁晓飞，张 荣，邹养军，查养良，张志林，孙广宇

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100；3.陕西省咸阳市园艺站，陕西咸阳 712000；4.陕西省永寿县园艺站，陕西永寿 713400)

苹果是中国农业的支柱产业之一，对农民的收入及脱贫致富具有重要作用。苹果花脸病和锈果病是由苹果锈果类病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)引起的类病毒病害，主要危害苹果果实，表现为“花脸”或“锈果”症状，果面着色不均、凹凸不平，或形成铁锈色病斑。该类病害不仅降低果实品质，而且直接影响商品价值，因而危害巨大，给果农造成严重的经济损失[1-2]。该类病害在山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江等苹果产区均有发生，在国内苹果主产区具有逐年增加的趋势，严重威胁苹果产业的安全与可持续发展[3-4]。类病毒是目前发现的最小的致病生物，对农作物造成巨大的危害[5]。类病毒病的控制是一个重要的难题，目前缺乏有效防治该病害的化学药剂。采用无毒苗木是控制类病毒发生及危害的最有效途径。在中国，由于尚没有无毒苗木使用的法规或条例，致使生产实践中采用无毒苗建园的比例较低，因而病毒和类病毒病害发生普遍。

植物免疫诱抗剂不直接杀死病菌或病毒，可以通过激活植物的防御反应，增强植物自身抗病水平，从而预防或减轻病害发生。利用蛋白诱抗剂诱导植物抗病性控制农作物病害，是一种新的病害防控手段。新型蛋白诱抗剂阿泰灵是由3%氨基寡糖和3%极细链格孢(Alternariatenuissima)激活蛋白配合而成的抗病毒蛋白质生物农药，主要通过蛋白激发子PeaT1和Hrip1激活植物的免疫系统并调节植物的新陈代谢，诱导植物产生系统抗性，提高相关抗病基因的表达[6]。阿泰灵对水稻条纹叶枯病、番茄黄化曲叶病、油菜菌核病等多种病害表现出良好的抗病作用[6-7]，但阿泰灵对苹果花脸病或锈果病的作用尚不清楚。植物病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein，PR蛋白)在病原物侵染及化学物质诱导下产生，使植物获得系统性抗性[8]。阿泰灵可以提高PR1、PR2和PR5等抗病相关基因在小麦中的转录表达水平，促进PR蛋白的产生可能是其提高寄主抗病性的重要作用机制之一[9]。

为探索新型蛋白诱抗剂阿泰灵防治苹果锈果类病毒病害的可能性，本研究分别在‘富士’‘G20’优系及‘秦蜜’等品种上开展田间防治效果试验，进而通过PR蛋白基因的表达分析其抗病机制，以期为苹果类病毒病害防治提供一种新途径。

1 材料与方法

1.1 田间果树选择与标记

2017年7月于旬邑果园调查患有苹果花脸病果树，病果率在80%以上，品种为‘G20’优系，品种特性为早熟品种，树龄4 a，对病树用油漆进行标记。

2017年9月于乾县果园调查患有苹果花脸病果树，病果率为20%～50%，选择病果率50%左右果园，品种为‘富士’，树龄15 a，对病树用油漆进行标记。

2017年9月于洛川果园调查患有苹果锈果病果树，病果率在80%以上，品种为‘秦蜜’，树龄 6 a，对病树用油漆进行标记。

1.2 阿泰灵田间药剂处理方法

药剂处理方法：根灌结合叶面喷洒处理，每颗树为1个处理，重复5～8次。阿泰灵为处理组，高岭土为对照组，处理与对照在同一行，自然分布。

根灌处理：于树体东、西、南、北4个方向挖4个30 cm坑，阿泰灵剂量为每棵15 g，用2 kg水将15 g阿泰灵制剂溶解，均匀倒入4个坑中。

叶面喷施：用浓度为1 g/kg的阿泰灵喷洒叶片，每棵树喷洒2 kg。

处理时间：‘G20’优系为2017年10月上旬、2018年3月下旬、4月下旬和5月下旬；‘富士’与‘秦蜜’品种为2017年10月上旬、2018年4月下旬、5月下旬和6月下旬。

1.3 病害发生程度调查及分析方法

调查时间：‘G20’优系为2018年7-9月；‘富士’与‘秦蜜’品种为2018年10月。

病果分级方法：对于花脸症状，病斑面积占果面面积10% 以下，为商品果，病斑面积占果面面积10% 以上，为病果；对于锈果症状，无论面积大小，出现锈果症状即按照病果统计。Student’st检验用于显著性分析(P<0.05)。

病果率= 病果数/果实总数×100%

防治效果= (对照组病果率-处理组病果率)/对照组病果率×100%

1.4 愈伤组织培育及处理

田间选取1 a生冬季休眠枝条，室内水培法培养，待枝条长出新芽约2 cm时，将其取下进行消毒；将消毒好的芽置于初代培养基上生长，及时去除污染及严重褐化的芽；将无污染的芽多次更换培养基，之后1个月即可获得苹果组培苗；将苹果组培苗的叶片切成4～6块，在诱导愈伤组织形成培养基暗培养15 d和光培养15 d交替处理获得苹果愈伤组织。

选取长势一致的愈伤块，转移到新的培养基上，每培养皿放置4块愈伤。将阿泰灵稀释1 000倍并用细菌过滤器过滤，用250 μL阿泰灵稀释液处理愈伤块；对照组用同体积的无菌水处理。选取0 h、12 h、24 h、36 h、48 h及60 h共6个时间点，试验重复3次。用灭菌的锡箔纸将样品包裹，迅速置于液氮中冷冻，置于-80℃冰箱中冷藏。

1.5 qRT-PCR检测病程相关蛋白基因表达量

RNA提取参照RNApre Pur多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)的方法。cDNA合成参照5′Integrated RT MasterMi试剂盒的方法。从GenBank下载苹果病程相关蛋白序列，利用Primer 5.0软件设计病程相关蛋白基因引物(表1)，引物序列由奥科生物科技有限公司合成。以苹果Actin基因作为内参基因[10]。用 qRT-PCR检测基因的转录水平，反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s；35个循环数； 72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存；反应体系(10 μL)：2′RealStar Green Power Mixture 5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，cDNA模板0.2 μL，正、反向引物各0.2 μL，RNase-free H2O 4.2 μL。试验数据采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 阿泰灵对苹果花脸病的防治效果

对于‘富士’品种，试验结果显示，阿泰灵处理组病果率为4.1%，对照组病果率为49.6%，防治效果为91.7%(图1)。‘G20’优系为早熟品种，7月中下旬成熟。在7月24日成熟期调查，结果显示，阿泰灵处理组病果率为7.2%，对照组病果率为93.0%，防治效果为92.3%；果实成熟期过以后，在8月10日调查，结果显示，阿泰灵处理组病果率为93.0%，对照组病果率为100%，阿泰灵处理组与对照组病果率差异不大(图2)。‘秦蜜’品种感染类病毒后轻者表现为花脸症状，严重时表现为锈果症状。试验结果显示，阿泰灵处理组锈果症状显著变轻或消失，但仍可表现为花脸，对表现花脸症状的果实仍然按照病果对待。调查显示阿泰灵处理组病果率为25.3%，对照组病果率为77.3%，防治效果为67.3%(图3)。上述试验结果表明：阿泰灵处理对花脸型和锈果型均具有显著防治效果。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

图2 阿泰灵处理‘G20’优系花脸病发病情况Fig.2 The incidence of apple skin scar viroid on strain ‘G20’ treated by Atailing

2.2 阿泰灵防治苹果花脸病的机制

采用稀释1 000倍的阿泰灵处理苹果愈伤组织，分析其病程相关蛋白基因的表达量，结果显示，在0～60 h，PR1a基因明显上调表达，60 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的5.0倍(图4)；在24～60 h，PR8基因明显上调表达，48 h时相对表达量最大，为对照组0 h表达量的41.2倍(图5)；在36～60 h，PR10a基因明显上调表达，48 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的7.8倍(图6)；在12～24 h及48～60 h，PR10b基因明显上调表达，24 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的7.4倍(图7)；在36～60 h，PR10c基因明显上调表达，60 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的7.9倍(图8)；在24～60 h，PR10 d基因明显上调表达，48 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的9.6倍(图9)；在48～60 h，DEF1基因轻微上调表达，60 h时相对表达量最大，是对照组0 h表达量的3.9倍(图10)。表明阿泰灵可以显著诱导多种病程相关蛋白基因的表达，可能通过诱导这些基因表达提高苹果对类病毒的抗病性。

图3 阿泰灵处理‘秦蜜’品种锈果病发病情况Fig.3 The incidence of apple skin scar viroid on variety ‘Qinmi’ treated by Atailing

图4 不同时间点 PR1a基因相对表达量Fig.4 Relative expression of PR1a gene in apple callus at different time points

图5 不同时间点 PR8基因相对表达量Fig.5 Relative expression of PR8 gene in apple callus at different time points

图6 不同时间点 PR10a基因相对表达量Fig.6 Relative expression of PR10a gene in apple callus at different time points

图7 不同时间点 PR10b基因相对表达量Fig.7 Relative expression of PR10b gene in apple callus at different time points

图8 不同时间点 PR10c基因相对表达量Fig.8 Relative expression of PR10c gene in apple callus at different time points

图9 不同时间点 PR10d 基因相对表达量Fig.9 Relative expression of PR10d gene in apple callus at different time points

图10 不同时间点 DEF1 基因相对表达量Fig.10 Relative expression of DEF1 gene in apple callus at different time points

3 结论与讨论

已有研究表明，阿泰灵对烤烟、蔬菜等病毒病有较好防治效果[11]。本研究通过果园防治试验，显示阿泰灵对苹果类病毒病也具有一定防治效果：对‘富士’品种花脸病的防治效果为91.7%；对‘G20’品系花脸病在成熟期的防治效果为92.3%，对‘秦蜜’品种锈果病的防治效果为67.3%。整体来看，对于‘富士’品种的花脸病防治效果较好，对于‘G20’品系在正常成熟时期防治效果较好，但过了成熟期未采摘则花脸症状加重；对于表现锈果症状的品种，可以显著消除锈果症状的表现，但仍会表现一定的花脸症状。说明阿泰灵在生产上具有一定的应用价值。但在试验期间，果树大小年、品种、成熟期、及田间施肥条件等对防治结果有一定的影响。因此，对不同品种的用药优化、阿泰灵结合施肥进一步提高防效等有待继续研究。

愈伤组织个体间差异比小，长势一致性高，是替代田间果树的优异试验材料。PR蛋白分为17个家族[12]，其中PR1a为抗真菌蛋白，PR8具有几丁质酶活性和抗真菌活性；PR10具有核酸酶和体外抗菌活性；DEF1属于PR12蛋白，在烟草中具有抗病毒活性。本试验表明，阿泰灵处理组的PR1a、PR8、PR10a、PR10b、PR10c、PR10d及DEF1蛋白基因不同程度上调表达，对PR8基因的诱导上调最显著，其次是PR10蛋白基因。PR蛋白的积累不仅提高了寄主抗病性，也有可能会影响植物生理状态进而影响病毒在植物体内的状态[13]。结合阿泰灵对田间苹果花脸病和锈果病的防治效果，推测阿泰灵可能通过诱导苹果果树生成大量PR蛋白，进而提高其对ASSVd的抗病性。阿泰灵对苹果花脸病的防治作用可能存在多种机制，有待进一步探索。